增强黄嘌呤氧化酶稳定性的固定化方法研究黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD），属黄素蛋白酶类，可将次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，继续氧化黄嘌呤为尿酸，并产生过氧化氢及超氧化物，是嘌呤代谢的关建酶 可用于检测血清无机磷、血清超氧化物岐化酶活力及胞外黄嘌呤、次黄嘌呤水平 在核苷类药物的合成中起到促进转化的作用，可用于提高 5-甲基尿苷、胸腺嘧啶核苷的合成产量不同生物来源的黄嘌呤氧化酶酶学性质具有差异性 来源于细菌的黄嘌呤氧化酶国内外研究较少，已报道黄嘌呤氧化酶的相对分子质量及亚基组成差异较大，蛋白结构组成的差异将导致酶催化性能及稳定性的不同 黄嘌呤氧化酶作为一种重要的氧化酶，其在医学诊断及工业催化中有应用前景，酶较差的稳定性影响其直接应用 已报道的提高酶稳定性的方法主要有添加保护剂、蛋白质工程、固定化方法等 其中，固定化方法因具有可连续反应性、可重复利用性等优点，备受关注 可使用的固定化载体主要有聚丙烯酰胺、壳聚糖、醋酸纤维素薄膜、树脂等国内外关于黄嘌呤氧化酶稳定性研究，主要集中于改进溶液环境提高酶热稳定性，对其固定化研究相对较少 前 期 经 SDS -PAGE 电 泳 分 析 知 ， 节 杆 菌Arthrobacter M3 黄嘌呤氧化酶含两个亚基， 相对分子质量约为 100 000 及 35 000，与 已 报道的 黄嘌呤氧化酶均不相同。
在此基础上，作者对此黄嘌呤氧化酶的酶学性质进一步分析，并利用修饰的琼脂糖介质及大孔阴离子交换树脂固定化黄嘌呤氧化酶 提供有效增强黄嘌呤氧化酶稳定性的固定化方法，也为其它酶类的稳定性研究提供参考 1 材料与方法 1.1 菌种来源 Arthrobacter M3：作者所在实验室保藏菌种 1.2 主要材料 黄嘌呤氧化酶标准品（相对分子质量 160 000）：近岸蛋白质科技有限公司提供；大孔阴离子交换树脂 （D201、201×4）， 浙江争光实业股份有限公司提供；Sepharose 4B： 通用电气医疗中国有限公司提供；乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDC）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司提供 1.3 主要仪器 V1100D 可见分光光度计： 美谱达仪器有限公司产品；电热恒温水浴锅：科辉仪器厂产品；蛋白电泳仪：美国 BIO-RAD 公司产品；pH 计（PB-10 型）：德国赛多利斯股份有限公司产品 1.4 培养及纯化方法 从固体平板挑取单菌落，接入种子培养液，30 ℃恒温振荡培养 12 h 后将种子培养液按体积分数3%接种量接入 60 mL （500 mL 锥形瓶） 发酵培养基，30 ℃、220 r/min 培养 20 h。
菌液破壁离心后，取上清酶液进行纯化，参考文献[17] 纯化后酶液经0.22 μm 滤膜过滤，置于 4 ℃保存备用 1.5 XOD 酶活测定方法 黄嘌呤氧化酶酶活测定方法详见参考文献酶活力单位定义：在 37 ℃下，每分钟形成 1 μmol 过氧化氢所需的酶量定义为 1 个酶活单位（U） 1.6 XOD 酶学性质分析 1.6.1 凝胶过滤确定 XOD 相对分子质量 以商业化的黄嘌呤氧化酶（相对分子质量 160 000）标准品为对照，利用安捷伦 SEC-5（7.5 mm×300 mm，5 μm）凝胶过滤柱测定 XOD 相对分子质量 测定条件：流动相 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.0），流量 0.5mL/min，进样量 40 μL，检测波长 280 nm 1.6.2 酶的最适反应温度及最适反应 pH 取一定浓度的稀释酶液，于 25~52 ℃水浴条件下进行酶活力测定，以活力最高者为 100%，计算不同温度下相对酶活 另取一定浓度的稀释酶液，于 37 ℃、不同pH 条 件下 （5.5~9.0）进 行 酶 活 力测定 ，以 活力 最 高者为 100%，计算不同 pH 条件下相对酶活。
1.6.3 金属离子对酶活的影响 在 pH 7.5 酶液中加入不同金属离子 （Ca2+、Mg2+、Fe3+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ag+、Hg2+），至终浓度为 2 mmol/L，混匀，测定各组酶活，以未加金属离子的酶液酶活为 100%，计算各组相对酶活 1.7 XOD 固定化方法比较 1.7.1 大孔阴离子交换树脂固定化 分 别称取 已预处理的 201×4 阴离子交换树脂及 D201 大孔阴离子交换树脂各 1.0 g 于 10 mL 离心管中， 加入 pH7.5 的酶液 6 mL，4 ℃、100 r/min 下振荡固定化 2 h 混合物 8 000 g 离心 5 min，测定上清酶活后用 20mmol/L 磷酸盐缓冲液洗涤至无酶析出，测定洗涤液酶活性及固定化酶活力，计算固定化酶载量及酶活回收率 将固定化的黄嘌呤氧化酶， 置于 50 ℃恒温水浴，2 h 后测定酶活力，各组以未加热处理的固定化酶酶活为 100%，计算各组固定化酶的相对酶活 1.7.2 琼脂糖介质的修饰及其固定化 参考 文献方法，分别先将间隔臂甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸交联于预处理的琼脂糖介质上，3 种修饰后的介质分别命名为琼脂糖-甘氨酸介质 （Sepharose-Gly）、琼脂糖-谷氨酸介质（Sepharose-Glu）、琼脂糖-天冬氨酸介质（Sepharose-Asp）。
称取不同的羧基载体各1.0 g 于 10 mL 离心管中， 添加酶液， 调节 pH 至6.5， 加入 EDC 共价交联固定化黄嘌呤氧化酶，4 ℃振荡固定 15 h，混合物 8 000 g 离心 5 min，测定上清酶活 后用 0.6 mol/L 氯化钠洗脱非共价交联的酶，至洗脱液无酶析出，再用 20 mmol/L 磷酸盐缓冲液洗涤，测定洗脱液、洗涤液酶活性及固定化酶活力，计算固定化酶载量及酶活回收率将各修饰的琼脂糖固定化酶置于 50 ℃恒温水浴，2 h 后测定酶活力，各组以未加热处理的固定化酶酶活为 100%，计算各组固定化酶的相对酶活 1.8 固定化化酶与游离酶热稳定性的比较 1.8.1 不同温度下固定化酶 与 游离酶热稳定性比较 将游离酶与固定化酶置于 20 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.5）中，不同温度下（25、35、45、55、65、75℃）保温 1 h，冷却至 4 ℃，测定各组酶活 以各组未做处理酶的酶活为 100%，计算相对酶活 1.8.2 固定化酶与游离酶最适稳定 pH 的比较 将酶液于不同 pH 条件下（5.5~8.5），50 ℃保温 1 h，冷却至 4 ℃， 测定各组酶活， 各组以 0 h 时酶活为100%，计算相对酶活。
1.8.3 固定化酶 与 游离酶 存储 稳定性的比 较 将固定化酶与游离酶置于 20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5）中，置于 50 ℃恒温水浴，定时取样，冷却至4 ℃，测定固定化酶与游离酶酶活力，各组以 0 h 时酶酶活为 100%，计算各组不同时间处相对酶活 2结果与讨论 2.1 XOD 酶学性质分析 2.1.1 XOD 相对分子量的确定 由前期研究 SDS-PAGE 电泳测得， 菌种 Arthrobacter M3 产的黄嘌呤氧化酶含两个亚基， 相对分子质量分别约为 100000 及 35 000 由图 1 凝胶过滤图谱知，黄嘌呤氧化酶标准品（相对分子质量 160 000）凝胶过滤出峰时间为 11.64 min，Arthrobacter M3 黄嘌呤氧化酶出峰时间则为 11.98 min，即比黄嘌呤氧化酶标准品相对分子质量略小综合判定，节杆菌 Arthrobacter M3黄嘌呤氧化酶为相对分子质量约 135 000 的异质二聚体蛋白 2.1.2 XOD 的最适反应温度及最适反应 pH 温度是影响酶反应效率的重要因素之一，一定范围内提高反应温度可加快反应速率。
在 25~52 ℃范围内进行酶活力测定，结果见图 2 由图 2 可知，37 ℃时测得 XOD 酶活力最高在不同 pH 值下进行酶酶活力测定， 结果见图3 该酶最适反应 pH 为 7.5，溶液 pH9.0时对酶活力测定影响较大 2.1.3 金属离子对酶活的影响 如表 1 所示，不同金属离子对 XOD 酶活影响具有差异性 Mn2 +对XOD 活性具有激活作用，相对酶活提高 35.6%，Co2+及 Zn2+对 XOD 酶活具有一定抑制作用，相对酶活分别降低 21.1%和 67.8%，Cu2+、Ag+、Hg2+对 XOD 酶活具有致死作用，这可能是由于 3 种金属离子作用于蛋白巯基，导致 XOD 变性失活 2.2 XOD 固定化方法比较 由表 2 可知，黄嘌呤氧化酶经不同方法固定化后，其热稳定性均不同程度的提高 大孔阴离子交换树脂固定化，D201 树脂的固定化效率优于 201×4 树脂， 这可能是由于 D201 树脂为大孔阴离子交换树脂，相比于普通 201×4 树脂，其颗粒内缝隙孔径较大，有利于蛋白及底物的进出 修饰的琼脂糖介质固定化，3 种固定化酶中，琼脂糖-谷氨酸介质固定化酶， 酶活回收率及热稳定性最佳， 固定化酶载量稍低于琼脂糖-甘氨酸介质固定化的酶。
这可能是由于，谷氨酸含有两个游离羧基，琼脂糖-谷氨酸介质可多点交联 XOD，使固定化酶更加牢固，稳定性增加，这同时也可能引起底物进入酶催化中心受阻，使得固定化酶表观酶活力（载量）下降 综合比较，修饰的琼脂糖介质固定效果化优于大孔阴离子交换树脂，D201 及 201×4 为含苯乙烯-二乙烯苯骨架的离子交换树脂， 对 XOD 的固定化作用主要靠离子键及疏水相互作用 而修饰的琼脂糖介质靠共价交联的方法固定 XOD，结合作用力强于 D201 及 201×4 树脂， 这可能致使其固定化效果优于 D201 及 201×4 树脂 2.3 固定化酶与游离酶热稳定性的比较 2.3.1 固定化酶与游离酶不同 温度下热稳定性比较 由上述固定化结果可知， 琼脂糖-谷氨酸介质固定化效率最佳，因此对其与游离酶的热稳定性性能进行比较 由图 4 可知，不同温度下保温 1 h，固定化的黄嘌呤氧化酶热稳定均优于游离酶 75 ℃保温 1 h，游离酶已几乎无酶活，琼脂糖-谷氨酸固定化酶仍剩余 22.1% 2.3.2 固定化酶与游离酶最适稳定 pH 分析 由图5 可知，在 pH 5.5~8.5 范围 内 ，50 ℃保 温 1 h，琼脂糖-谷氨酸固定化酶剩余的相对酶活均高于45%，而游离酶在较低酸碱条件下加热处理， 酶活损失较大。
pH 8.5 下剩余的相对酶活仅为 2.1%由此可知，琼脂糖-谷氨酸固定化酶比游离酶具有更强的酸碱抵抗能力 2.3.3 固定化酶 与游离酶存储稳定性的比 较 将琼脂糖-谷氨酸固定化酶与游离酶置于 50 ℃保温，二者相对酶活随时间变化曲线见图 6 由图可知，游离酶放置 3 h 后，相对酶活仅剩余 8.0%，而琼脂糖-谷氨酸固定化酶仍剩余 48.3%， 半衰期由游离酶的0.84 h 延长至固定化酶的 2.2 h，提高了 1.6 倍 3结 语 节杆菌 Arthrobacter M3 黄嘌呤氧化酶为含两个不同亚基的异质二聚体，相对分子质量为 135 000，与所报道文献中均不同，其最适反应温度为 37 ℃，最反应 pH 为 7.5 采用修饰的琼脂糖介质及大孔阴离子交换树脂对黄。