附录4 硫代巴比妥酸反应物法（TBARS）1 目的 利用TBARS法进行样品的抗氧化能力评价2原理 丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress)时，会发生脂质氧化一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括MDA此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标丙二醛在较高温度及酸性环境中可与TBA发生反应，形成红色的MDA-TBA加合物，MDA-TBA加合物在535nm处有最大吸收，据此可以通过比色法进行检测另外，MDA-TBA加合物也可以在535nm被激发产生最大发射波长553nm，据此也可以进行荧光检测3 试剂或材料 四乙氧基丙烷，硫代巴比妥酸4 仪器设备 荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管5 操作步骤5.1 试剂配制10 mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，棕色瓶4 ℃保存12个月），临用前用纯水稀释成1 nmol/mL；29 mmol/L硫代巴比妥酸工作液：硫代巴比妥酸 0.209 g， EDTA.2H20 25 mg，谷胱甘肽（还原型） 1 mg，用0.02 mol/L NaOH 50 mL 溶解（微温助溶，棕色瓶4℃保存2周）；酸水解液：0.1mol/L H2SO4 125 mL，0.1mol/L Na2SO4 125 mL 加水150 mL用 H2SO4 调pH 1.5，加水稀释至500 mL。
5.2 标准曲线制作将10 nmol/mL四乙氧基丙烷，用双蒸水稀释成0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10 nmol/mL分别取0.1 mL加入酸水解液 2 mL 、TBA工作液0.5mL混匀，避光、沸水浴60 min，流水冷却至室温，用3mL正丁醇振荡抽提1 min，3000 r/min离心5 min；取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5 nm，出射狭缝5 nm，激发波长536 nm，发射波长550 nm）以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图5.3 样品测定取测试物0.1 mL，加入酸水解液 2mL、TBA工作液0.5mL，混匀，避光、沸水浴60 min；流水冷却至室温；3 mL正丁醇振荡抽提1 min，3000 r/min离心5 min，取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5 nm，出射狭缝5 nm， 激发波长536 nm，发射波长550 nm）表1 实验试剂的添加量（mL） 空白组样品组标准组蒸馏水0.1 --样品-0.1-标准品--0.1酸水解液222TBA工作液0.50.50.56 结果计算 过氧化脂质含量计算公式如下：式中：A——空白管荧光值B——样品荧光值F——四乙氧基丙烷荧光值C——四乙氧基丙烷浓度（1nmol/mL）K——稀释倍数 附录5铁离子还原能力（FRAP）测定1 目的 应用铁离子还原能力对样品的抗氧化能力进行评价。
2 原理 基于氧化还原反应的比色法，在低pH的溶液中，Fe3+-TPTZ（Fe3+-三吡啶三嗪）被抗氧化剂还原成Fe2+-TPTZ，使反应液变成深蓝色，在593 nm处有最大光吸收，这样通过测量样品吸光度的变化来测量其抗氧化能力吸光值越高表示样品的还原力也就越强3 试剂或材料 TPTZ，乙醇，盐酸，醋酸钠，醋酸，硫酸亚铁，硫酸4 仪器设备 紫外分光光度计5 操作步骤5.1 试剂配制 样品液：用乙醇配制浓度分别为0.24, 0.48, 0.72, 0.96, 1.20 mg/mL样品溶液 40 mmol/L盐酸溶液：取浓盐酸(12 mol/L) 0.1 mL加水至30 mL，置于避光处，备用 0.3 mol/L醋酸钠缓冲溶液：称取醋酸钠5.1 g，加冰醋酸20 mL，用水稀释定容至250 mL，置于避光处，备用 10 mmol/L TPTZ溶液：称取TPTZ样品31.233 mg，用40 mmol/L的盐酸定容至10 mL，置于冰箱中冷藏备用 FRAP工作液：2.5 mL 10 mmol/L的TPTZ溶液，2.5 mL 20 mmol/L 的FeCl36H2O和25 mL 0.3mol/L的醋酸缓冲液（pH3.6）混合均匀即得。
5.2 FeSO4标准曲线的绘制 准确称取6.08 mg硫酸亚铁，溶于适量的水中，加入18 mol/L的硫酸0.25 mL, 再加水稀释至50 mL容，并置入小铁钉取上述溶液5 mL, 加入5 mL水，定容至50 mL，为800 μmol/LFeSO4标准溶液用该溶液配制梯度FeSO4溶液，包括400 μmol/L，200 μmol/L，100 μmol/L，50 μmol/L和25 μmol/L，于593 nm测定吸光值，绘制标准曲线5.3 测定 取样品0.3 mL，加2.7 mL预热至37℃的FRAP工作液，摇匀后放置10 min，于593 nm测其吸光度值，以无水乙醇代替样品加入FRAP工作液作为空白，每个浓度做3次，求平均值根据所得吸光值，在标准曲线上求得相应FeSO4浓度，定义为FRAP值，其值越大，抗氧化活性越强表1 实验试剂的添加量（mL） 试剂空白组样品组标准组蒸馏水0.3 --样品-0.3-标准品--0.3FRAP工作液2.72.72.76 结果计算 FRAP值用 FeSO4 标准溶液的浓度来表示例如某样品测定获得的吸光值和1mM FeSO4 标准溶液的吸光值相同，则该血浆样品的FRAP值即为1mM。