巯基化合物在铁氰化钢薄膜修饰玻碳电极上的电催化氧化及其液相色谱安培测定李惠梅汪尔康*（中国科学院长春应用化学研究所电分析化学开放研究实验室长春130022）提要在酸性介质中，铁氰化铟薄膜修饰玻碳电极（InHCF/GC）大大催化了巯基化合物的氧化比较了不同制备方法所得修饰电极的稳定性全氟代磺酸Nafion涂敷于修饰电极表面增强了其在流动体系中的稳定性液相色谱分离检测了半胱氨酸、还原型谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸线性范围达2个数量级检测限为1.7ng、10.0ng和6.0ng关键词液相色谱，安培检测法，修饰电极前言由于半胱氨酸（Cys）、谷胱甘肽（Gsh）和N-乙酰半胱氨酸（Acy）在生物医学上的重要性，已建立了一些液相色谱电化学（LCEC）的测定方法，如在汞[1-3]、金属汞齐[4-5]、金[6]碳糊[7]和玻碳[8]电极上的检测这些安培检测方法的不同之处在于电极氧化过程和所施加的电位在汞基电极上的检测是电氧化汞产生硫化物可在较负电位下进行以提高选择性，但由于汞的毒性、电极响应的快速钝化[5]及滴汞电极的使用不便等原因限制了其应用改用碳糊电极直接氧化巯基化合物进行检则，附加电位正于1.0V方可得到较满意的结果[7]，这是由于巯基化合物在这类电极上有较高的氧化过电位。
基于化学修饰电极（CME）显著优越性（抗沾污、有选择性和对分析物的活化作用等），Zagal[9]报道了吸附性钴酞菁Copc四磺酸盐修饰石墨电极电催化氧化CysBaldwin等[10,11]使用含Copc的碳糊电极降低了巯基化合物的氧化过电位，于0.75V（相对于Ag/AgCl参比电极）检测了Cys、Acy和高半胱氨酸，并分析了血浆和全血中Cys和Gsh的含量Hart等[12,13]用Copc修饰碳-环氧树脂电极于0.45V（相对于Ag/AgCl参比电极）进行色谱分离，并用安培检测法测定了GshKulys[1]用四氰喹啉并二甲烷、四硫化富瓦烯和1,3-二甲基二茂铁修饰电极进行电催化氧化并检测了Cys和GshChen等[15]用Nafion-Os(bpy)2+3+3修饰电极LCEC法测定了巯基化合物Wang[1]和Cox[17分别用普鲁士蓝薄膜修饰电极和六氰合钌修饰电极LCEC法检测了Cys和Gsh等巯基化合物铁氰化铟薄膜修饰电极的制备和性质研究已有报道[18,19]，本文首次报道了InHCF/GC对Cys、Gsh和Acy的电催化氧化，比较了不同制备方法所得电极的稳定性，并用LCEC法检测了Cys、Gsh和Acy。
2实验部分试剂和仪器DL-半胱氨酸（上海曹阳二中）、还原型谷胱甘肽（上海生化研究所）、N-乙酰半胱氨酸（军事医学科学院放射医学研究所）为生化试剂其它所用试剂均为分析纯5%Nafion的乙醇溶液（Aldrich）用乙醇稀释至2%Nafion待用所用分析物溶液以流动相配制，4C保存流动相为0.1mol/L KH2PO4(H3PO4调pH至3.0，其中含50μmol/L EDTA二钠盐)，流速1.0mL/min通讯联系人本文收稿日期：1992年12月11日，修回日期:1993年3月16日国产79-1型伏安分析仪（济南无线电四厂）用于循环伏安实验和修饰电极的制备玻碳电极（12mm2）为工作电极，Ag/AgCl（饱和KCl溶液）为参比电极，Pt为对极色谱系统包括：法国Gilson公司306型泵，Rheodyne(Model 7125)进样阀（20μ蘈L样品环），Nu-cleosil C18(7um)200×4mm i.d.分析色谱柱（大连化学物理研究所填制）Model-400（玻碳-MP1305 GCE美国EG&G公司）用于电化学检测，Model 30-286和EPSON LQ-550 PHILIPS P3348分别用于系统控制、色谱图记录和打印。
2.2电极制备先将玻碳电极于抛光布上用0.05m的α-A12充分抛光后用二次蒸馏水超声清洗几次，得到未修饰的玻碳电极GCE0，将GCE0插入1mmol/LIn3+与1mmol/L Fe (CN)-的混合溶液中（lmol/LKCl配制，调pH至2.0），于0→1.1V扫描（50mv/s）15min取出，用0.01mol/L的盐酸清洗几次后，于pH3.0的0.5mo1/L KCl溶液中0→1.1V扫描到得出一稳定的伏安曲线后取出晾干，随后用2％的Nafion溶液10L涂于表面，自然晾干，即为制成的修饰电极CME1将GCE0插入已通N2(10min)除氧的1mmol/LIn3-与Fe(CN)3-（1mol/LKCl配制，pH2.0）溶剂中，于-0.5V电位下电沉积15min，取出后再按CME1的后处理方法处理，得CME2GCE0在OV吸附15min（后处理同CME1）得CME23结果与讨论3.1不同CME的性能比较图1是CME1制备过程的伏安图可见0.8V处氧化／还原峰（对应于Fe(CN)-/Fe(CN)-电子转移过程[18,19]）随扫描时间的增加不断增长，是一典型吸附过程对应于0.38V和0.34V处有一对氧化还原峰，随扫描时间的增加峰电流逐渐降低，且这对峰在In3-溶液中不出现，目前尚不清楚其存在原因。
图2为GCE0和所得修饰电极CME1～獵CME3在底液（pH3.0,0.2mol/L KH2PO4）和对Cys的氧化、催化氧化的循环伏安图由图2看出，在0.8V左右出现一对氧化还原波，这是由于微溶性的In-Fe-CN化合物沉积于电极表面，其中Fe(CN)33／Fe(CN)-发生电子传递过程之故[1]：InⅢFeⅢ(CN)6+e+K+=KInFe(CN)6K+作为平衡离子自由出入膜中比较a、b、c与b'可见，CME1獵CME3对Cys的氧化均有催化作用，但CME1和CME3对Cys的催化活性随使用次数增加呈下降趋势，这也可由表1看出由表1还可看出，CME3虽稳定性稍好，但催化电流较低（与CME2相比）比较CME2与CME2（不涂Nafion）的数据可知，Nafion膜的使用虽降低了催化电流，却增加了稳定性（相对标准偏差4.2%，n=8），故选用CME2作为LCEC检测的工作电极3.2 CME2常规电解池实验表1不同修饰电极LCEC检测Cys的电流I（nA）值Cys为0.10mmol/L流速：1.OmL/min流动相：0.lmol/L KH2PO4(pH3.0)，检测电位：1.0V图3为Cys、Gsh、Acy于常规电解池中在CME2和GCE0上的循环伏安图。
由图看出，在GCE0上，Cys、Gsh、Acy均在1.0V左右有氧化电流，但无明显氧化峰，氧化电流亦较小在CME2上，在底液中加入Cys、Gsh、Acy时，0.8V左右的氧化峰电流明显增加，还原峰电流减小，且催化氧化电流与被分析物浓度成正比这一过程为不可逆的氧化过程可见CME2的使用增大了氧化电流，有利于提高检测灵敏度Cys、Gsh、Acy的催化氧化产物并不明显钝化电极，实验中每扫描一周后，搅拌溶液再扫，其催化氧化峰的IP、E均不改变，说明CME2对它们有稳定的催化作用，在流动体系中也一样（表1）循环伏安实验表明1P与E12成正比（10.～null250mV实验范围），随扫描速度增加，峰电位略正移溶液的pH值在2.0～6.0范围内变化时，CME2在底液和分析物溶液中的循环伏安图几乎无变化，pH值太大时，膜易损LCEC实验选择pH3.0的溶液作为流动相3.3 LCEC检测Cys、Gsh和Acy注射固定浓度的标准溶液，电位在0.6～1.1V范围内变化，测得三种物质在GCE0和CME2上的LCEC动态伏安图（图4）可见，在CME2上，Cys、Gsh、Acy均有大的电流响应（较GCEO）且在1.0V附近趋于平台电流，所以选择1.0V为检测电位。
在此电位下CME2检测比GCE0更灵敏当流动相为0.1mol/L KH2PO4（含50μmol/LEDTA，pH3.0），流速为1.0mL/min和检测电位为1.0V时，Cys、Gsh和Acy得到良好的分离和检测（图5）在1h内，连续八次重复进样，Cys、Gsh和Acy检测的电流值的相对标准偏差分别为4.2％和4.6％LCEC检测Cys、Gsh和Acy的线性范围分别为1.7ng～null726ng、10.0ng～816ng、6.0ng～2.4g标准曲线的斜率为227pA/ng、31.1pA/ng和173pA/ng线性相关系数为0.999、0.999和0.997检测限分别为1.7ng、10.Ong和6.Ong（信噪比为3）综上所述，利用InHCF/GC修饰电极对半胱氨酸、还原型谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸的催化氧化作用，可以提高其在LCEC分析测定中的灵敏度，并得到了宽的线性范围本方法简便、可靠、灵敏，可用于实际工作中微量巯基化合物的分析测定参考文献1 Rabenstein DL,Saetre R.Anal Chem.1977;49:10362 Saetre R,Rabenstein DL.Anal Chem,1978;50:2763 Saetre R,Rabenstein DL.Anal Bichem.1978;90:6844 Allison L A.Shoup RE.Anal Chem,1983;55:85 Bergstrom RF,Kay DR,Wayner JG.J Chromatogr,1981;222:4456 Freuzig K.Frank J.J Chromatogr,1981;218:6157 Mefford I.Adams RN.Life Sci.1978;23:11678 Shaw IC.McLean A E M.Boult CH.J Chromatogr,1983;275:2069 Zagal J,Fierro C,Razas R.J Electroanal Chem,1981;119:40310 Halbert M K,Baldwin R P.Anal Chem.1985;57(3):59111 Halbert M K,Baldwin RP.J Chromatogr,1985;345(1):4312 Wring S A.Hart JP,Birch BJ.Analyst.1989;114:156313 Wring SA,Hart JP,Birch BJ.Analyst.1989;114:157114 Kulys J.Druggiliene A.Anal Chim Acta,1991;243:28715 Chen X,Xia B,He P.J Electroanal Chem,1990;281:18516 Hou W.Wang E.J Electroanal Chem,1991;316:15517 Cox JA.Gray TJ.Electroanalysis,1990;2:10718 Kulesza PJ,Faszynska M.J Electroanal Chem,1988;252:46119 Jin Z.Dong S.Electrochimica Acta,1990;35:1057Electrocatalytic Oxidation and Amperometric Determination ofSulfhydryl Compounds at an Indium HexacyanoferrateFilm Glassy Carbon Electrode in Liquid ChromatographyLi Huimei,Wang Erkang*(Laboratory of Electroanalytical Chemistry,Changchun Instituteof Applied Chemistry,the Chinese Academy of Sciences,Changchun,130022)An indium hexacyanoferrate (InHCF) fi。