分子标记及其在植物分子标记及其在植物遗传育种中的应用遗传育种中的应用12021/11/17遗传标记（genetic marker）具有多型性易于鉴别与目标基因紧密连锁 性状标记 色泽， 形态 细胞学标记 倒位，易位，G/N/C带 生化标记 同功酶 分子标记 RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP 基础基础- -基因表达基因表达结果结果表现型表现型DNADNA碱基碱基序列变异序列变异22021/11/17形态标记形态标记n n遗传学上稳定、可见的外部特征遗传学上稳定、可见的外部特征-遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果l l如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等vv特点：直观简单特点：直观简单l l从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异环节，表型差异有时难以反映基因型差异 32021/11/17细胞学标记细胞学标记n n染色体数目变异及结构变异，表现在染色体染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（和带型（C C带、带、N N带、带、GG带等）。
带等）l l随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异可在染色体水平揭示更多遗传变异vv特点：直观、快速而经济，但变异十分有限特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨当染色体数目形态相似时难以分辨 42021/11/17生化标记生化标记贮藏蛋白和同工酶贮藏蛋白和同工酶n n贮藏蛋白贮藏蛋白 同工酶同工酶vv特点：经济、方便、成本较低特点：经济、方便、成本较低vv结构基因表达产物，对非结构基因无能结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响数量有限，有时受发育时期和环境影响52021/11/17分子标记分子标记本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：（1 1）不受季节、环境、基因表达与否的限制；）不受季节、环境、基因表达与否的限制；（2 2）多态性高，存在着丰富的等位变异；）多态性高，存在着丰富的等位变异； （3 3）数量丰富，多态性遍及整个基因组；）数量丰富，多态性遍及整个基因组；（4 4）表现为）表现为“ “中性中性” ”，不影响目标性状的表达，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；与不良性状无必然的连锁；（5 5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。
合基因型，提供完整的信息62021/11/17分子标记的分类（分子标记的分类（StaubStaub等等19961996）分子标记以Southern为基础如RFLP以PCR为基础单引物PCR标记 有RAPD、 AP-PCR、DAF、ISSR等双引物选择性扩增PCR 主要指AFLP需克隆、测序构建特殊双引物PCR标记如SSR、STS等72021/11/17植物遗传研究中常用的分子标记植物遗传研究中常用的分子标记n nRFLPRestrictionFragmentLengthRFLPRestrictionFragmentLengthPolymorphismPolymorphismn nRAPDRandomAmplifiedPolymorphicRAPDRandomAmplifiedPolymorphicDNAsDNAs (DAF,AP-PCR)(DAF,AP-PCR)n nSSRSimpleSequenceRepeatSSRSimpleSequenceRepeatn nAFLPAmplifiedFragmentLengthAFLPAmplifiedFragmentLengthPolymorphismPolymorphism82021/11/17RFLPRFLPn n原理：原理：DNADNA限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切电泳电泳转移到硝酸纤维素滤膜转移到硝酸纤维素滤膜同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交胶片放射自显影，显示酶切片段大小胶片放射自显影，显示酶切片段大小92021/11/17n n酶切：酶切：3-5ugDNA3-5ugDNA，以以1010U U内切酶酶切内切酶酶切5 5小时小时 n n电泳：电泳：0.6-0.8%0.6-0.8%琼脂糖胶琼脂糖胶7070V V电泳电泳1616小时小时 n n染色：染色：EtBrEtBr染色染色2020分钟分钟 n nMHCl20MHCl20分钟，抽真空，水冼分钟，抽真空，水冼n n印迹：加入印迹：加入0.4NNaOH0.4NNaOH，进行进行SouthernSouthern印迹印迹n n冲洗：以冲洗：以2 2SSCSSC冼胶，风干冼胶，风干酶切电泳印迹102021/11/17杂交杂交洗脱洗脱n n预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、55HSBHSB、DenhardtDenhardt）中，中， 封好后置封好后置6565温温箱中振荡箱中振荡5 56 6小时。
小时n n杂交：预杂交液中加入标记好的杂交：预杂交液中加入标记好的markermarker和和探针，放入杂交膜浸匀封好杂交盒后，置探针，放入杂交膜浸匀封好杂交盒后，置6565温箱中振荡过夜温箱中振荡过夜n n洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液6565 振荡洗脱两次（振荡洗脱两次（1515min/min/次）次），吸干包好吸干包好112021/11/17放射自显影放射自显影将洗脱好的杂交膜置于增感屏上将洗脱好的杂交膜置于增感屏上, ,于暗室于暗室中将中将 X-X-光片放于杂交膜上，光片放于杂交膜上， 再放上另一再放上另一张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好置张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好置- -7070超低温冰箱中曝光超低温冰箱中曝光1010天左右使用磷屏仪，操作更方便使用磷屏仪，操作更方便122021/11/17RFLPRFLP探针探针n n来源：来源：cDNAcDNA探针与基因组探针与基因组DNADNA（gDNAgDNA）探针探针n ncDNAcDNA探针探针: :保守性较强，探针检测的多态性频率保守性较强，探针检测的多态性频率较低n ngDNAgDNA探针探针: :检测的多态性频率较高，但不同种属检测的多态性频率较高，但不同种属特异性较强。
特异性较强n n玉米玉米RFLPRFLP探针：探针：http:/probes. Htmlhttp:/probes. Html132021/11/17探针标记探针标记随机引物法随机引物法n n2525ngng变性变性DNADNAn n5 5ulul寡聚核苷酸寡聚核苷酸n n2ulBSA2ulBSAn n3ul-3ul-3232PdCTPPdCTPn n2 2ulKlenowulKlenow酶酶n n加水至加水至5050ulul，3737温箱中标记温箱中标记2 2小时小时142021/11/17RFLPRFLP标记标记特点特点l 共显性，可以区别纯合和杂合基因型l 稳定、重复性强l 某些植物中开发探针已遍及整个基因组l 缺点：DNA需要量较大，技术复杂； 用于做图较费时，难以分析大量样品； 在基因组较大、严格自花授粉作物上多态性很低，使遗传图饱和度低152021/11/17RAPDRAPDn n原理：原理：用一个随机引物（用一个随机引物（8-108-10bpbp）、）、碱基随碱基随机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩增基因组增基因组DNADNA，然后电泳分开扩增片然后电泳分开扩增片段。
段162021/11/17Polymerase Chain Reaction-PCRPolymerase Chain Reaction-PCR3553Target DNA sequenceGCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGdenature 95 C5335GCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCanneal primers 60 CTaq polymerase binds 3 and extendsGCTCGC5335AGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCDNA is doubled with each cycleRepeat 25-40 times172021/11/17RAPDRAPD的操作的操作PCRPCR反应：反应：DNADNA（20ng/l20ng/l）1l1lPrimerPrimer15ng15ngMgMg2+2+ Taq Taq酶（酶（5 5加水至加水至2020l l，再加入石腊油，进行再加入石腊油，进行PCRPCR扩增扩增182021/11/17Step195Step19522分钟分钟Step295Step2951515秒秒Step336Step3363030秒秒Step472Step4724545秒秒Step5GOTOStep246Step5GOTOStep246循环循环Step6Step6727255分钟分钟 PCR扩增：192021/11/17主要特点主要特点 无需杂交，设计引物也无须知道序列信息；无需杂交，设计引物也无须知道序列信息； DNADNA需要量少，引物便宜，成本较低；需要量少，引物便宜，成本较低； 技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术。
交和放射性自显影等技术 不同物种间引物通用；不同物种间引物通用； vv缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合子；实验重复性较差，结果可靠性较低子；实验重复性较差，结果可靠性较低202021/11/17DAFDAF(DNA amplification fingerprinting)(DNA amplification fingerprinting)：与与RAPDRAPD不同的是不同的是: :引物浓度更高，引物长度更短（一般引物浓度更高，引物长度更短（一般5 58 8个碱基），且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳个碱基），且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，通常会产生非常复杂的带型，谱带信息，通常会产生非常复杂的带型，谱带信息比比RAPDsRAPDs大得多 （Caetano-AnollesCaetano-Anolles等，等，19901990）212021/11/17AP-PCR(arbitrarily primed AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction)polymerase chain reaction)l l引物较长（引物较长（10105050bpbp）；l l引物浓度较高；引物浓度较高；l l引物长度不定，并且常常来自为其它引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物（如目的而设计的引物（如M13M13通用测序通用测序引物）。
引物）222021/11/17ISSRISSR232021/11/17l l 共同优点：共同优点： 在不需要知道所扩增在不需要知道所扩增DNADNA序列情况下，序列情况下，产生产生DNADNA片段的指纹；片段的指纹； 需需DNADNA量少，产生多态性丰富量少，产生多态性丰富l l 缺点：缺点：l l 对反应条件非常敏感，重复性差对反应条件非常敏感，重复性差242021/11/17SCARsSCARs（Sequenced Characterized Amplified RegionsSequenced Character。