显微镜基础知识第一章：显微镜简史随着科学技术的进步，人们越来越需要观察微观世界，显微镜正是这样的设备，它突 破了人类的视觉极限，使之延伸到肉眼无法看清的细微结构显微镜是从十五世纪开始发展起来 从简单的放大镜的基础上设计出来的单透镜显微镜，到1847年德国蔡司研制的结构复杂的复式显微镜，以及相差，荧光，偏光，显微观察方 式的出现，使之更广范地应用于金属材料，生物学，化工等领域第二章显微镜的基本光学原理一 .折射和折射率光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物 体时，则发生折射现像，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的当与透明物面不垂 直的光线由空气射入透明物体 （如玻璃）时，光线在其介面改变了方向，并和法线构成折射角二 .透镜的性能透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件，物镜、目镜及聚光镜等部件均由单 个和多个透镜组成依其外形的不同，可分为凸透镜 （正透镜）和凹透镜（负透镜）两大类当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称“焦点”，通过交点并 垂直光轴的平面，称“焦平面”焦点有两个，在物方空间的焦点，称“物方焦点”，该处 的焦平面，称“物方焦平面”；反之，在像方空间的焦点，称“像方焦点”，该处的焦平面， 称“像方焦平面”。
光线通过凹透镜后， 成正立虚像，而凸透镜则成正立实像 实像可在屏幕上显现出来,而虚像不能三 .影响成像的关键因素一像差由于客观条件，任何光学系统都不能生成理论上理想的像，各种像差的存在影响了成 像质量下面分别简要介绍各种像差1 . 色差 （Chromatic aberration ）色差是透镜成像的一个严重缺陷，发生在多色光为光源的情况下，单色光不产生色差白光由红 橙黄绿 青蓝紫 七种组成，各种光的波长不同 ，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物方一个点，在像方则可能形成一个色斑光学系统最主要的功能就是消 色差色差一般有位置色差，放大率色差位置色差使像在任何位置观察都带有色斑或晕 环，使像模糊不清而放大率色差使像带有彩色边缘2 .球差(Spherical aberration)球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形表面造成的球差造成的结果是，一 个点成像后，不在是个亮点，而是一个中间亮边缘逐渐模糊的亮斑，从而影响成像质量球差的矫正常利用透镜组合来消除，由于凸、凹透镜的球差是相反的，可选配不同 材料的凸凹透镜胶合起来给予消除旧型号显微镜，物镜的球差没有完全矫正，应与相应的 补偿目镜配合，才能达到纠正效果。
一般新型显微镜的球差完全由物镜消除3 .慧差(Coma)慧差属轴外点的单色像差轴外物点以大孔径光束成像时， 发出的光束通过透镜后,不再相交一点，则一光点的像便会得到一逗点状，型如慧星，故称“慧差”4 . 像散(Astigmatism )像散也是影响清晰度的轴外点单色像差当视场很大时，边缘上的物点离光轴远， 光束倾斜大，经透镜后则引起像散像散使原来的物点在成像后变成两个分离并且相互垂直 的短线，在理想像平面上综合后，形成一个椭圆形的斑点像散是通过复杂的透镜组合来消 除5 . 场曲(Curvature of field )场曲又称“像场弯曲”当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想像点重合， 虽然在每个特定点都能得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面这样在镜检时不能同 时看清整个像面，给观察和照相造成困难因此研究用显微镜的物镜一般都是平场物镜，这 种物镜已经矫正了场曲6 .畸变(Distortion )前面所说各种像差除场曲外，都影响像的清晰度畸变是另一种性质的像差，光束 的同心性不受到破坏因此，不影响像的清晰度，但使像与原物体比，在形状上造成失真7 .显微镜的成像(几何成像)原理显微镜之所以能将被检物体进行放大，是通过透镜来实现的。
单透镜成像具有像差， 严重影响成像质量因此显微镜的主要光学部件都由透镜组合而成从透镜的性能可知，只 有凸透镜才能起放大作用，而凹透镜不行显微镜的物镜与目镜虽都由透镜组合而成，但相当于一个凸透镜为便于了解显微镜的放大原理，简要说明一下凸透镜的 5种成像规律：（1）当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在像方二倍焦距以内、焦点以外形成 缩小的倒立实像；（2）当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在像方二倍焦距上形成同样大小的倒立 实像；（3）当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在像方二倍焦距以外形成 放大的倒立实像；（4）当物体位于透镜物方焦点上时，则像方不能成像；（5）当物体位于透镜物方焦点以内时，则像方也无像的形成，而在透镜物方的同侧 比物体远的位置形成放大的直立虚像显微镜的成像原理就是利用上述（ 3）和（5）的规律把物体放大的当物体处在物镜前F-2F （F为物方焦距）之间，则在物镜像方的二倍焦距以外形成放大的倒立实像在显微 镜的设计上，将此像落在目镜的一倍焦距 F1之内，使物镜所放大的第一次像（中间像），又被目镜再一次放大，最终在目镜的物方（中间像的同侧）、人眼的明视距离（ 250mm处形成放大的直立（相对中间像而言）虚像。
因此，当我们在镜检时，通过目镜（不另加转换棱镜） 看到的像于原物体的像，方向相反8 .显微镜光学系统简介显微镜光学系统的设计有三种光学系统1 .长筒光学系统2 .万能无限远校正光学系统：是较先进的光路设计，它体现了无限远校正方式 的优越性光线通过物镜后成为平行光束通过镜筒，并在结像透镜处折射或完成无像差的中 间像物镜与观察筒内结像透镜之间可添加光学附件，而不影响总放大倍数另外这种光学 系统不需要安装附加校正透镜，都能得到最佳的显微图像3 .万能无限远双重色差校正光学系统：是目前最先进的光路设计，不但能矫正位置色差，同时还能矫正倍率色差可提高水平分辨率 12%提供最高反差、 最高衬度、最高分辨率的最锐利图象第三章显微镜的重要光学技术参数在镜检时，人们总是希望能得到清晰而明亮的理想图像，这就需要显微镜的各项光学 技术参数达到一定的标准，并且要求在使用时，必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系只有这样，才能充分发挥显微镜应有的性能，得到满意的镜检效果显微镜的光学技术参数包括： 数值孔径、分辨率、 放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时， 应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系。
一.数值孔径数值孔径简写 NA（蔡司公司的数彳！孔径简写 CF）,数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低 （即消位置色差的能力，蔡司公司的数值孔是代表消位置色差和倍率色差的能力 ）,的重要标志其数值的大小，分别标科在物镜和聚光镜的外壳上数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（不）和孔径角（ u）半 数的正玄之乘积用公式表示如下： NA=r］ sinu/2孔径角又称“镜口角”，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它 与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比显微镜观察时，若想增大 NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率Y］值基于这一原理，就产生了水浸系物镜和油浸物镜，因介质的折射率 Y］值大于一，NA值就能大于一数值孔径最大值为 1.4 ,这个数值在理论上和技术上都达到了极限目前，有用折射率高的澳蔡作介质，澳蔡的折射率为 1.66,所以NA值可大于1.4 o这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的 NA值应等于或略大于物镜的 NA值,数值孔径与其它技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其它各项技术参数。
它与分 辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比， NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小二.分辨率分辨率又称“鉴别率”，“解像力”是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数显 微镜的分辨率用公式表示为：d=0.61人/NA式中 d为最小分辨距离；入 为光线的波长；NA为 物镜的数值孔径可见物镜的分辨率是由物镜的 NA值与照明光源的波长两个因素决定 NA值越大，照明光线波长越短，则 d值越小，分辨率就越高1 .要提高分辨率，即减小 d值，可采取以下措施 降低波长 入值，使用短波长光源2 .曾大介质 Y］值和提高 NA值（NA彳sinu/2 ）3 .消色差4 .增加明暗反差三.放大率放大率就是放大倍数，是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图像的大小对原物体大小的比值，是物镜和目镜放大倍数的乘积放大率也是显微镜的重 要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好，在选择时应首先考虑物镜的数值孔径四.焦深焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点 平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部 分的厚度就是焦深焦深大 ，可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的 一薄层，焦深与其它技术参数有以下关系：1 .焦深与总放大倍数及物镜的数值孔镜成反比。
2 .焦深大，分辨率降低由于低倍物镜的景深较大，所以在低倍物镜照相时造成困难在显微照相时将详细介 绍五. 视场直径(Field of view )观察显微镜时，所看到的明亮的原形范围叫视场，它的大小，是由目镜里的视场光 阑决定的视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的 实际范围视场直径 23最为科学，大视场容易引起场曲 F=FN/Mob F:视场直径，FN:视场数，Mob:物镜放大率视场数(Field Number, 简写为FN),标刻在目镜的镜筒外侧由公式可看出：1 .视场直径与视场数成正比2 .增大物镜的倍数，则视场直径减小因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全 貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份六.覆盖差显微镜的光学系统也包括盖玻片在内由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入 空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了像差，这就是覆盖差覆盖差的产生影响了 显微镜的成像质量国际上规定，盖玻片的标准厚度为 0.17mm,许可范围在0.16—0.18mm.,在物镜的制造上已将此厚度范围的像差计算在内 物镜外壳上标记 0.17,即表明该物镜要求盖玻片的厚度。
七.工作距离工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离镜检时，被检物 体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦， 实际上是调节工作距离在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大数值孔径 大的高倍物镜，其工作距离小第四章显微镜的光学附件显微镜的光学部件包括物镜，目镜，聚光镜及照明装置几个部分各光学部件都直接 决定和影响光学性能的优劣，现分述如下：一.物镜物镜是显微镜最重要的光学部件，利用光线使被检物体第一次成像，因而直接关系和 影响成像的质量和各项光学技术参数，是衡量一台显微镜质量的首要标准国际物镜的检测 标准是以蔡司物镜为基准的物镜的结构复杂，制作精密，由于对像差的校正，金属的物镜 筒内由相隔一定距离并被固定的透镜组组合而成物镜有许多具体的要求，如合轴 ，齐焦齐焦既是在镜检时，当用某一倍率的物镜观察图像清晰后，在转换另一倍率的物镜时，其成像 亦应基本清晰，而且像的中心偏离也应该在一定的范围内，也就是合轴程度齐焦性能的。