植物组织培养实验报告学院:生命科学技术学院班级:10生技植物班学号：植物组织培养实验报告一、 实验目的1．掌握无菌操作的植物组织培养方法；2. 通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法；3．通过诱导豌豆根、茎、叶形成愈伤组织 学习愈伤组织的建立方法； 4．通过诱导豌豆茎、叶形成愈伤组织 学习愈伤组织的建立方法； 5．了解植物细胞通过分裂、增殖、分化、发育 , 最终长成完整再生植 株的过程, 加深对植物细胞的全能性的理解二、 实验原理（一） 植物组织培养植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其 在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程植物的组 织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组 织结构的细胞团，即愈伤组织这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分 化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组 织和器官，这一过程称“再分化作用”二） 植物细胞的全能性植物细胞的全能性即是每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套 遗传基因，在一定培养条件下每个细胞都可发育成一个与母体一样的植株三） 组织的分化与器官建成外植体诱导出愈伤组织后，经过继代培养，可以在愈伤组织内部形成 一类分生组织即具有分生能力的小细胞团，然后，再分化成不同的器官原基。
有些情况下，外植体不经愈伤组织而直接诱导出芽、根四） 培养基的组成培养基中各成分的比例及浓度与细胞或组织的生长或分化所需要的最佳 条件相近，似成功地使用该培养基进行组织培养的主要条件营养培养基一般 由无机营养、碳源和能源、维生素、植物激素（生长调节剂）和包括有机氮、 酸和复杂物质的添加剂组成三、 实验器材高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养室 镊子、记号笔、橡皮筋、玻璃器皿、三角烧瓶、烧杯、量筒、剪刀、棉塞、绳子、牛皮纸、酒精灯、喷雾 器等四、 实验材料豌豆种子五、 实验药品药品、70%酒精、0.1%升汞、MS培养基、蒸馏水、NaOH、 84消毒 液、蔗糖、琼脂等六、 实验步骤一）培养基母液的配制表1.MS培养基个成分的含量（单位：mg/L）成分 含量NH NO 16504 3KNO 19003KHPO 1702 4CaC l・ 2HO 4402 2MgS O・ 7HO 3704 2FeSO ・4HO 27.84 2Na-EDTA 37.3MnS O・ 7HO 22.3成分 含量ZnS O・ 7HO 8.64 2HBO 6.23 3KI 0.83Na MnO・ 2H O 0.252 4 2CuS O・5HO 0.0254 2CoC l・ 6HO 0.0252 、 2肌醇 100甘氨酸 2成分含量盐酸硫胺素0.4盐酸吡哆醇0.5烟酸0.5蔗糖30000琼脂8000PH6.0表2.MS培养基所需母液以及扩大倍数名称扩大倍数定容体积（ml）吸取毫升数/L大量元素5050020微量元素5050020Ca盐5050020Mg盐5050020Fe盐5050020有机10020010肌醇10020010激素100505注：吸取毫升数为每升培养基所吸取的母液的体积）表3.配制母液所需的药品及称取量（注：根据表1与表2计算各物质的称取量）药品名称 称取量（mg） 药品名称 称取量（mg）NH NO 41250 Ki 20.7543KNO 47500 NaMnO・2HO 6.253 2 4 2KHPO 4250 CuSO・5HO 0.6252 4 4 2药品名称称取量(mg) 药品名称 称取量(mg)CaCl ・2H022MgSO・7HO42FeSO・4HO42Na-EDTA11000 CoCl ・6H0 0.625229250 肌醇 2000695 甘氨酸 40932.5 盐酸硫胺素 8MnSO・7HO557.5 盐酸吡哆醇 1042ZnSO・7HO42HBO215 烟酸 10155(1) MS大量元素母液的配制参考表3称取一定量的下列药品用蒸馏水溶解，定容至500ML存放于冰 箱中备用。
名称重量(mg) 名称 重量(mg)NHNO43KNO41250 KHPO4 4250247500 CaCl ・2H 0 11000(2) MS微量元素母液参考表3称取一定量的下列药品用蒸馏水溶解，定容至500ML存放于冰 箱中备用名称重量(mg) 名称 重量(mg)KIHB033MnSO ・ 7H 04220.75 Na Mo0・ 2H 0 6.252 4 2155 CuSO ・ 5H0 0.62542557.5 CoCl ・6H0 0.62522ZnSO ・7H 0215(3) MS有机母液参考表3称取一定量的下列药品用蒸馏水溶解，定容至200ML存放于冰 箱中备用名称重量(mg) 名称 重量(mg)肌醇烟酸 盐酸吡哆醇2000 盐酸硫胺素 810 甘氨酸 4010(4) MS铁盐母液的配制参考表3称取一定量的下列药品用蒸馏水溶解，定容至500ML存放于冰 箱中备用名称重量(mg) 名称 重量(mg)EDTA 二钠932.5 FeS04 ・ 4H20 695(5) MS钙盐母液的配制参考表3称取llOOOmg的CaCl・2H O用蒸馏水溶解定容至500ML,保存22 于冰箱备用6) MS镁盐母液的配制参考表3称取9250mg的MgSO・7H O用蒸馏水溶解定容至500ML，保存于42 冰箱备用。
7) MS肌醇母液的配制参考表3称取2000mg的肌醇用蒸馏水溶解定容至200ML,保存于冰箱备 用8) MS激素母液的配制 各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的 盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容一般取100mg配成100ml母液二) 培养基的配制以配制1L的MS培养基为例进行如下操作：(1) 取1L的大烧杯，加入适量的蒸馏水在电磁炉上加热至沸腾；(2) 分别取(一)中配制的8种母液放入小烧杯中，然后加入，边加边搅 拌；(3) 称取30g蔗糖加入，边加边搅拌；(4) 称取8g琼脂加入，边加边搅拌，知之琼脂粉溶解；(5) 定容至1L，加入激素母液，用NaOH调PH6.0左右；(6) 将培养基分别分装于洗好的三角瓶中，塞上棉塞包上牛皮纸用绳子扎 紧；( 7 )放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌2 0分钟左右； (8)灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固三) 高压蒸汽灭菌锅的使用方法具体操作步骤：(1) 高压锅放水至平把架；(2) 把包扎好的培养基装入高压锅；(3) 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀；(4) 然后接通电源；(5) 压力计升至0.05MPa时，打开放气阀，排除冷空气(此步很重要)；(6) 排除冷空气后，关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭 菌时间，具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至 0.11MPa时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟；(7) 灭菌时间达到 20分钟后，除去电源，打开放气阀(注意要逐渐放气)待 高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后 再把培养基取出；(8) 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能 检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25°C下保存4天，如果培养基需 要贮存较长时间，可在4°C低温下保存。
总结：高压灭菌锅的使用方法可归纳为：进水一放进培养基一盖紧锅盖 f关上放汽阀f检查安全阀f接上加热源f待压力升至0.05MPa时排锅内冷空 气，关上放气阀f0.11MPa(121°C)下灭菌20~25分钟，保持稳定压力一除热源 一逐渐打开放气阀一锅内空气排除完后一开放锅盖一稍冷后取出培养基四) 、无菌操作技术1、 植物材料表面——消毒剂灭菌从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物这些污染源一 旦带入培养基，便会造成培养基污染因此，植物材料必须经严格的表面灭菌 处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种2、 接种步骤：第一步：清理材料一一流水冲洗一一加入吐温(或洗衣粉)清洗一一自来水冲洗；第二步：对材料的表面浸润灭菌：70%酒精浸10-30秒一一无菌水；第三步：灭菌剂处理一一 0.1T%升汞5-8 min (或其他灭菌剂)； 第四步：无菌水进行冲洗注意事项：(1) 灭菌剂一般要临时配制，现配现用.升汞可以短期储存；(2) 对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗3 -4次，升汞一般5-8次，每次不少于3 min；(3) 灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底；(4) 灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止；(5) 灭菌液要充分浸没材料。
3、 无菌操作可按以下步骤进行：(1) 在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯 进行杀菌；(2) 在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；(3) 接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；(4) 上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处然后搽拭工作台面；(5) 先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；材料 吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割 （如叶 片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段微茎尖要剥成只含1-2片叶 原基）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染；（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌 30 分钟，若连续接 种，每5天要大强度灭菌一次五）豌豆的萌发与豌豆外植体的接种1、准备 打开超净工作台，将镊子酒精灯放如超净工作台中，用紫外灯照20min后关闭紫外灯，同时将豌豆种子用自来水冲20min关闭紫外灯后在台 上点燃 2 个酒精灯，用棉球将镊子烧4次，超净作台少2次。
将灭菌溶 液，无菌水， 豌豆，大烧杯等放入超净工作台2、 灭菌 在超净工作台上取经浸泡处理的豌豆，先用酒精倒入种子瓶中约2／3 消毒一次（l-2s）接着用无菌水冲洗一次再用84消毒液摇晃清洗清洗3 次，每次 5 分钟，清洗完后用无菌水冲洗一次而后用 0.5%HgCl 泡 8min，处理2次，每次5分钟后用无菌 水摇晃清洗4-5次3、 接种 将所要用的三角瓶用75％的酒精喷湿，接着把手喷湿并把三角瓶带入 超净工作台接着将灭菌处理好的豌豆种子在超净工作台上用镊子靠近酒 精灯的外焰放入向下倾斜的锥形瓶。