精品Clontech-Lenti-Clontech-Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User ManualX™ Lentiviral Expression Systems User ManualProtocol No. PT5135-1Protocol No. PT5135-1慢病毒包装操作说明慢病毒包装操作说明A.A. 用用 Lenti-X HTX Packaging SystemLenti-X HTX Packaging System 生产慢病毒悬浮物生产慢病毒悬浮物为了获得最高效价的病毒悬液，用 Lenti-X 293T 细胞系，严格尊守以下说明，尤其尊守（1）培养体系和培养量（2）DNA 的量和转染质量（3）无四环素血清（4）孵育时间所有的 Xfect™转染成份， 量和条件最好用 Lenti-X Vectors， Lenti-X HTX 包装混合物，Lenti-X 293T 细胞用 10cm 组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成 包装病毒需要有微生物安全等级2 的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。
61.转染 24 小时前，在 10cm 培养板接种 4-5×10 个 293T 细胞，添加 10ml 的生长培养基在 37℃，5%CO2℃条件下过夜在进行第7 步前确保培养血有 80-90%的覆盖率2.充分混均 Xfect Polymer3.每个转染样品需准备两个离心管，按顺序添加如下试剂Tube 1(Plasmid DNA) Tube 2(Polymer)557µl Xfect Reaction Buffer 592.5µl Xfect ReactionBuffer36µl Lenti-X HTX Packaging Mix 7.5µl Xfect Polymer7µl Lenti-X Vector DNA(1µg/µl)600µl 总量600µl 总量注意：注意：Xfect PolymerXfect Polymer 不要在室温下搁置长于不要在室温下搁置长于 30min30min4.充分混均每个管5.把 Tube2 添加到 Tube1 中，中速涡旋 10 秒。
6.在室混下孵育 DNA-Xfect 混合物 10min，这时可形成纳米复合物7.把 1200µl 的 DNA-Xfect 溶液（第 5 步制备）加入到第 1 步准备好的细胞中，前后左右轻轻晃动培养血，使其均匀8.在 37℃条件下培养9.4 小时或过夜后，换 10ml 的完全生长培养基，在 37℃条件下在培养 24-48h病毒滴定量在 48h 后可达到最高注意：移弃的培养液包含了可感染的慢病毒注意：移弃的培养液包含了可感染的慢病毒10. 吸取慢病毒悬液在 500g 下离心 10min注意：悬浮液包含可感染的慢病毒注意：悬浮液包含可感染的慢病毒TM11. 用 Lenti-X GoStix 鉴定病毒产物或者滴定病毒株然后可用病毒产物转导靶细胞也可在-80℃保存可编辑 精品B：Lenti-Viruses 转导靶细胞1.转导前 12-18h，用完全生长培养基培养靶细胞2.轻轻混合冻融的病毒株或从细胞包装得到的病毒株，不要涡旋需要提醒的是每次的冻融都降低 2-4 倍的病毒效价3.根据靶细胞的培养液的量调节病毒和聚凝胺的添加量在转导中可用足量的聚凝胺（e.g.4µg/ml ）来获得需要的最终浓度4.用细胞培养液稀释病毒株，获得需要的 MOI。
如要不知道病毒效价，可连续稀释病毒株或包装悬液，使得用于转导的病毒总量不会超过病毒包装时培养液的1/35.在靶细胞中加入病毒悬液，转导8-24h离心的培养液可以增加感染效率6.移除丢弃存留病毒的转导培养液，换成新鲜的生长培养液 注意：移弃的培养液包含可注意：移弃的培养液包含可感染的慢病毒7.继续培养细胞 24-48h，在靶细胞中积累基因产物8.收集细胞进行分析，或者用合适的抗生素再进行筛选注意：为了检测转导效率，可以选取少量细胞用抗生素处理剩余的细胞可进行后续的分注意：为了检测转导效率，可以选取少量细胞用抗生素处理剩余的细胞可进行后续的分析细胞进可能用完，但不要转导后少于析细胞进可能用完，但不要转导后少于 24h24h 内进行分析内进行分析 .可编辑 。