一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的， 经过一系列改进后，目前已 经成 为最常用的转化方法共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生 质 体、 悬浮培养细胞、叶盘、茎段等共同培养的一种转化方法（图6－1）三、材料及方法1．含目的基因共整合载体或双元 载体的根癌农杆菌2．植物幼苗一）细菌培养液直接浸染法操作：（1）无菌受体材料的准备：叶片、茎段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源① 取自无菌 试 管苗② 取自田 间或温室栽培植株：叶片、茎尖、茎段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分2）受体材料预培养：将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、茎切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导 或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下：预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大 时即可进行侵染3）农杆菌培养：① 从平板上挑取单菌落，接种到 20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0 ）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD 600 为0.6～0.8。
② 取OD 600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD 600为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/ 的AS；（4）侵染：于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料 对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）从培养瓶中取出 预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当 时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）取出外植体置于无菌滤纸 上吸去附着的菌液5）共培养：将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上（烟草为MS 十IAA0.5mg/L BA2.0mg/L) ，在28℃暗培养条件下共培养 2～4 天（光对某些植物的转化有抑制作用，故需暗培养，共培养时间因不同植物而异）6）选择培养：将经过共培养的外植体转移到加有选择压（以NPT－Ⅱ为标记基因时一般使用卡那霉素，烟草以100mg/L 的选择浓度为宜，其它植物需通 过敏感实验确定）的脱菌（附加 250～500mg/L 的羧苄青霉素或头孢霉素，抑制 农杆菌生长）分化或愈伤组织诱导 培养基上，在光照 为2000～10000lx、25℃条件下 进行选择培养。
7）继代选择培养：选择培养2～3 周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或 产生抗性愈 伤组织，将 这些抗性材料转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养，或 转入附加选择压的生 长或分化培养基中令其生长或诱导分化8）生根培养：待不定芽长到1cm 以上时，切下并插入含有选择压 的生根培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根二）细菌的植物组织培养基悬浮液浸染法此方法与上述的细菌培养液直接侵染法不同之处是用于侵染的农杆菌被悬浮在植物组织培养液（如1 / 2MS 、MS 或其它培养液中），而不是细菌培养液（如YEB 或LB 等）中具体做法有两种：（1）在超净工作台上，将按上述方法培养的OD 600 为0.6～0.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，4000r/min 离心 5 分钟，去掉上清液．菌体用MS 液体培养基（pH5.4～5.8）重悬 ，稀释至OD 600为0.2 左右，用于转化2）另一方法是取适量的OD 600为0.6～0.8 的菌液加入到30 ～50 倍体积无激素的组织培养液体培养基中（pH5.8)，（同时可加入100μmol/L 的AS ) ，在上述条件下继续振荡培养 2 ～ 4 小时，至 OD600为0.2 左右时用于侵染。
说明：（1）上述的各种做法．包括加入 AS 及不加AS ，都能 获得一定的 转化率侵染时采用哪种做法，除要根据受位材料及菌株情况选定外，也有个人的 习惯2）如果共培养后，外植体周围 菌体很多， 转入选择培养时 ，可先用液体MS 培养基冲洗材料．吸干液体后再转入选择培养基但 这种作法常常引起材料 损伤，应尽量避免3）为提高转化细胞成活率，可采用哺育 细胞看护培养及延 迟筛选的方法哺育 细胞看护培羌是以迅速生长的植物细胞悬浮系（常用胡萝卜悬浮细胞系）为哺育细胞共培养对在共培养的培养基表面铺上一层哺育细胞层，然后覆盖一 张无菌滤纸，将侵染后的材料成在滤纸上面进行共培养，哺育细胞的滋养有利于转 化细胞成活所 谓延迟筛选是指共培养后的材料不 马上转入筛选培养基中，而是先转入只含有抑制 农杆菌生长的抗生素（如 羧苄青霉素或头孢霉素），不含 选择压（如卡那霉素）的分化或愈伤组织诱导培养基中培养5 ～10 天（称脱菌培养），然后再转入具有 选择压的筛选培养基中 进行抗性筛选延 迟筛选的好处是转化细胞受非转化细胞滋养有利于成活，缺点是常造成“ 逃逸”（假转化）现象及嵌合体出现 （三）CpTI 基因叶盘法转化甘蓝材料：（1）农杆菌LBA4404 ( pRCL27 ）。
2）甘蓝种子操作：1 ．受体材料准备：甘蓝种子用水漂洗，70 ％乙醇消毒1 分 钟，0.1 ％的升汞消毒20～30 分钟，无菌水冲洗5 遍播种于无菌0.7％固体琼脂培养基上，阳光下培养6～7 天2 ．配制培养基预培养培养基：MS IAA 0.2 BA2.0共培养培养基：同上脱菌培养基：MS IAA 0.2 BA2.0＋ Cef 500mg / L筛选培养基：MS IAA 0.2 BA2.0 Cef 500mg / L 十Km 25mg / L生根培养基：1 / 2 MS IBA 0.5 十Km 25mg / L抗生素用无菌滤膜过滤，添加在高 压灭菌后冷至50 ℃左右的培养基中，用力摇匀（可将磁棒与培养基一起灭菌，加入抗生素后，置磁力搅拌器上搅匀）后分装于无菌培养皿中，生根培养基分装于三角瓶中3．农杆菌培养（1）挑取单菌落，接种于20mL YEB Km 25mg / L Rif 50mg / L 液体培养基中，27℃、180r/min培养过夜2）取400μl 菌液转接入20mL 无抗生素的YEB 液体培养中，继续培养4～6 小时3）在超净工作台上，将菌液倒入无菌 带盖离心管内，盖上管盖，用石蜡膜封口，4000r/min 离心5 分钟。
4）取出离心管，在超净工作台上弃去上清向离心管内加入适量无菌MS 液体培养基，悬浮起菌体，转入无菌容器中，用MS 液体培养基稀释至OD 600≈0.2 4 ．叶盘法转化（1）取培养6～7 天的甘蓝无菌幼苗，将胚 轴剪成5～8mm 长的小段，子叶带子叶柄剪下，转入预培养培养基中，于25℃，光照条件下预培养2 天2）将预培养的材料取出，放在无菌的小培养皿中，保留培养基3）向皿中倒入稀释好的菌液， 轻轻摇晃2～3 下，立即取出胚轴切段及子叶，置无菌滤纸上吸去多余菌液4）将子叶及胚轴切段放回到原预培养的培养基中，盖上培养皿盖，用石蜡膜封口，于27℃，黑暗中共培养2 天5）将材料转入到脱菌培养基中，于 26℃ ，光照条件下培养6～7 天6）将脱菌培养基中的材料转入筛选培养基中，同 样条件下培养2～3 周有绿芽分化7）将绿芽转入筛选培养基，2 周更换一次新鲜的筛选培养基，筛选培养3～4 代，淘汰白化的及畸型苗（8）选择形态正常，生长旺盛的抗性 绿苗， 转入生根培养基中，15 天后可见幼根生成待根系形成后取出小苗，自来水洗净根上的琼脂，移入珍珠岩与草炭土1 ：1 混合的基质中，于温室中培养9）取生长良好的植株叶片提取DNA ， 进行PCR 扩增及Southern 杂交鉴定。
说明：LBA4404 (pRCL27）为双元 载体，所含 pRCL27 质粒的T－DNA 中有NPT 一l 基因和以CaMV35S 启动子调控的CpTI 基因由中科院 遗传 所朱祯实验室构建四）悬浮细胞与农杆菌共培养转化目的：以悬浮培养的单细胞或细胞团为受体，与 农杆菌共培养 实现目的基因转化，并通 过再生获得转基因植株材料：（1）烟草愈伤组织2）含NPT-Ⅱ基因质粒载体的 农杆菌菌株3）悬浮培养液：愈伤组织培养基成分中增加2,4－D 浓度，可至2mg/L；VB1 、VB6 浓度可增至10mg/L；烟酸浓度可增至5mg/L，并加入水解酪蛋白1g/L操作：1. 悬浮细胞系的建立(1) 在150mL 的三角瓶中加入约50mL 的悬浮培养液2) 取生长快，松散的愈伤组织转入悬浮培养液中，24℃ 、100r/min 振荡培养3) 每隔3 天转入新培养液中继代一次2. 农杆菌培养（1）将农杆菌接种在YEB 液体培养基中，于 28℃、200 r/min 振荡培养至OD 600为0.6～0.82）取20mL 菌液置无菌离心管中，4000r/min 离心5 分钟，收集菌体3）用细胞悬浮培养液重悬菌体，并稀 释至OD 6000.25 左右，置冰上待用。
4）另一种做法是取lmL 菌液加入到50～100mL 新鲜的YEB ( pH7.0）或细胞悬浮培养液中（pH5.8) ，同时加入l000mol/LAS 继续培养至OD 6000.25 左右，约4～6 小时，放置冰上待用3 ．共培养转化（1）将农杆菌液置20℃平衡几分钟2）取4mL 处于对数生长期的植物细胞悬浮液放入直径为10cm 的培养皿中3）再加入4mL 平衡好的农杆菌液混匀，于28℃静止培养2 天4 ．转化体筛选（1）将共培养物低速离心（700r/min ) ，弃上清2）加入细胞悬浮培养液洗涤细胞沉淀3 次3）最后用含500ug/mL 羧苄青霉素或头孢霉素及100 ug/mL 卡那霉素的选择细胞悬浮培养液重悬细胞沉淀，于 24℃100r/min 条件下进行选择培养4）当出现微小愈伤组织后转入固体选择培养基上进行愈伤组织继代选择培养 5 ．愈伤组织分化及生根培养：愈 伤组织转入附加卡那霉素的固体分化培养基中 诱导分化，将分化出的幼苗转入附加卡那霉素的生根培养基中培养说明：共培养时不要振荡，培养条件必 须有利于细胞旺盛分裂，才能得到较好效果五）原生质体与农杆菌共培养转化目的：以原生质体为受体细胞， 进行农杆菌介导的目的基因 转化。
材料：烟草，带目的基因的根癌 农杆菌试剂 ：（1）原生质体分离缓冲液：0.07 % MES [ 2 , ( N－吗琳)－乙基磺酸] ，0.07 % CaC12 , 0.11%NaH2PO4 , 0.5mol/L 甘露醇（pH5.8 ）2）原生质体分离酶液：l%～2蝜lμlase onozuka R －10（纤维素酶R－10) , 0.1% MacerozymeR10（果胶酶R10)，溶于原生质体分离缓冲液（pH5.8 ）3）16 ％蔗糖溶液操作：1．烟草叶肉原生质体制备：(1) 以12 周龄烟草植株为试材，选取已伸展开的幼嫩叶片按下面程序进行表面消毒：①浸于70％乙醇30 秒，无菌水冲洗1 次②浸入 5％次氯酸钠溶液（其中可加入少 许Tween20) 30 分钟，无菌水冲洗3 遍③浸入1％次氯酸钠溶液10 分钟，无菌水冲洗 3 次2) 无菌操作剪碎叶片，放入培养皿中，加入25mL 左右的原生质体分离酶液，于 28℃、20～30min 轻摇4～6 小时3) 用倒置显微镜观察原生质体分离情况4) 将分离良好的原生质体悬液，用60～8μm 孔径的滤网过滤，原生质体进入滤液5) 滤液经600r/min 离心5 分钟，原生 质体沉于管底，除去上清酶液。
6) 离心管内加入2mL 原生质体分离缓冲液重悬沉淀，然后在管底 缓缓加人16％蔗糖溶液 800r/min。