原位所需试剂用 dH2O 配置，溶液高压灭菌 40min 即可 材料固定材料固定 材料放入固定液中， 抽真空 1hr 至材料完全浸末到固定中， 更换新的固定液， 室温放置 3~6hr Fixative：4% paraformaldehyde, 0.25% glutaraldehyde (EM grade), 2.5ml 10XBuffer, 12.5ml distilled water, pH 7.2~7.4 Check pH 10% paraformaldehyde: 10 grams paraformaldhyde in ~70ml distilled water. Add 1 drop of 10N NaOH to stimulate solving and place for 20min at 70℃ (in waterbath).Adjust pH to 6.8 and volume to 100ml. (Solution can be stored in the dark at 4℃ up to one month) 10XBuffer=100mM sodium Phosphate pH 6.8 supplemented with 1M NaCl 68.4ml 0.1M Na2HPO4 31.6ml 0.1M NaH2PO4 5.84g NaCl 脱水、浸蜡脱水、浸蜡 1) Remove fixative and pass through the following dehydration steps: - 1X Buffer, H2O,10% ethanol, 30% ethanol, 50% ethanol, 70% ethanol, 80% ethanol, 90% ethanol and 96% ethanol for 20min; 100% ethanol for 3X1h 2) Remove ethanol and replace subsequently with xylene: - 1:3, 1:1, 3:1 ethanol:xylene; 2X100% xylene, 60min for each step 3) Overlay xylene with molten paraffin. 3:1, 1:1, 1:3 xylene:paraffin, for two days at 60℃.100% paraffin for two days, and be replaced at least 4 times - 石蜡在脱水前要置于 60℃融化，过夜。
- Transfer the vials to 60℃ and pour off the paraffin-xylene solution quickly. 包埋包埋 适量 60℃的石蜡放入预热的锡箔纸模具中，在石蜡的中的材料倒入其中用解剖针和镊子 摆好材料的方向模具放入冰上，待石蜡凝固后，4℃保存 以上过程需要时间为一周左右在此过程中，材料在固定液、100%乙醇、以及 3：1 的二甲 苯和石蜡的混合液中可以过夜浸蜡过程需要 4-5 天时间 准备 1.5mlEp 管，DEPC 处理的枪头，dH2O，DEPC 水 100ml，1M Tris-HCl pH8.0 Preparation of sildes（需要 2 天时间） 1) 盖玻片、载玻片的处理 - 洗洁精清洗载玻片（100 片）和盖玻片（300 片） ，自来水缓慢水流冲洗 2hr，10%HCl 浸泡过夜市售盐酸浓度为 36% - 载玻片装入提篮中，流水冲洗 2hr，晾干盖玻片流水冲洗 2hr，100%乙醇漂洗，100% 丙酮 dip，晾干锡箔纸包好载玻片和盖玻片，180℃烘烤 3hr Kaka2) 载玻片放入含有 100ug/ml poly-L-lysine (sigma) solution in 10mM Tris-HCl for at least 10min. Slides are air dried to obtain even coating of the slides. Store coated slides at -20℃ in a box sealed with tape. - Poly-L-lysine can be stored at -20℃, preferably as a stock of 4 mg/ml 切片、脱蜡、检片切片、脱蜡、检片（2 天以上） - 将材料从 4℃拿出，室温放置 1hr 左右。
- Cut 8μm think sections with steel knife, 连续切片切好的蜡带置于电光纸上 - coat 好的载玻片放于 42℃的烫台上，加 1ml DEPC 水用针头把蜡带切成盖玻片长度， 挑取置于载片上摆好蜡带之后，用吸水纸吸干载玻片上的水 - 片子 42℃烘烤过夜 - Put slides in 100% xylene for 30min; transfer the slides to 50% xylene (in 100% ethanol) for 20min; transfer the slides to 100% ethanol for 10min; Air dry the slides. - 镜检需要的片子，-20℃保存，待用 探针标记探针标记（标记时间为 2 天） 1) 探针长度一般 500~1000kb，连入 T-easy vector鉴定插入的方向SP6 作为引物测序， 如果方向与基因方向相反，则用 SP6 polymerase 合成出来的为 antisense probe，质粒 用 NcoI 酶切T7 polymerase 则用 SalI 酶切质粒。
Polymerase 在转录过程中，以 3’-5’ 的链为模板，转录出 5’-3’的链 （Promega 公司酶不错，NEB 的酶不好用，切记） 2) 原位探针标记体系: DNA template 9μl (1μg) 5XTrans Buffer 4μl DTT(100mM) 2μl RNA polymerase 2μl RNA Inhibitor 1μl rNTP-DIG labeling 2μl total 20μl 37℃ incubate 2.5hr 3) 反应结束后加 RNase free H2O 33ul DNaseI 2μl DNaseI Buffer 6μl Total 60μl 37℃ incubate 1hr，取 1μl 电泳检测 DNA 是否消化完全 （是否有 DNA 残余，对后继实 验影响不大） 4) 在剩余溶液中加 0.5M EDTA 7.5μl 4M LiCl 7.5μl 100% Ethanol 225μl -20℃ overnight 5) 12000g 4℃离心 20min，70% ethanol wash 沉淀，风干后溶于 20μl DEPC 水中，取 1μl 电 泳检测，并测 OD 定量(77B antisense 940ng/1μl, clone 8; sense 860ng/1μl, clone 4)。
20℃ 保存备用 KakaDAY1: 杂交前处理、探针消化、杂交过程一天内完成早晨来后需打开 37℃水浴，蛋白酶 K buffer 预热，准备至少 6 个缸（可加 400ml 溶液） ，1L、500ml、200ml 干烤的玻璃两桶各 3~4 个， 需 1XPBS 大约 6L，sterile water 6L 杂交前处理杂交前处理 1) 镜检的片子从-20℃拿出，室温放置至少 1hr 再打开锡箔 2) 乙醇梯度：2X100%、90%、70%、50%、30%、10%、3Xsterile water，每个梯度 2~3min 乙醇梯度可以重复使用于后面的脱水过程，100% ethanol 更换即可 3） 100mM Tris-HCl pH 7.5、 50mM EDTA 溶液先 37℃预热， 用前再加入 1μg/ml Proteinase K， 枪头搅拌混匀片子放入后，37℃处理 30min 4) 2mg/ml glycine in PBS 溶液中 2min；PBS 溶液中 2minX2 （PBS 配制见前固定材料） 5）4% paraformaldehyde in PBS 10 min; PBS 溶液 5minX2 6）0.1M triethanolamine in PBS 中，pH 8.0 at room temperature for 10min。
3-乙醇胺为液体，M=149.称取 5.96g 要缓慢逐滴加入到 400ml PBS 中， 并加入 1.6ml 浓 HCl 调节 pH 7）在同一个缸中加入 0.25% acetic anhydride（400ml 溶液加 1ml）and incubate for 10min. 8) Sterile water wash 2minX3 9) Ethanol series: 10%、30%、50%、70%、90%、100%X2，各 2min 10）真空干燥，大于 1hr 探针消化探针消化 长片段的探针消化为大约 150bp 的片段， 后面杂交实验， 需要与没有消化的探针混合在一起 做杂交反应因此只需消化一半用量的探针即可 1) Mix 50μl labeled RNA with 301μl 0.2M Na2CO3 and 0.2M NaHCO3 0.2M Na2CO3 M=105.99 1.06g/50ml 0.2M NaHCO3 M=84.01 0.84g/50ml2) Incubate at 60℃ for the time calculated according to the formula: t=(L0-Lf)/(KXL0XLf) t= time in min, L0=starting length (in Kb), Lf=desired final length (in Kb), K=0.11 3) Stop the reaction by adding 3μl 3M sodium acetate (pH 6.0) and 5μl 10% glacial acetic acid. 80ml 水中加入 40.18g 三水乙酸钠， 冰乙酸调 pH 值 6.0， 定容到 100ml。
分装灭菌 每张片子 100ng 探针Antisense 27 张，sense 3 张 1.5μl antisene +48.5μlDEPC+30μl Na2CO3+20μl NaHCO3 0.1875μl sense+5μl DEPC+3μl Na2CO3+2μl NaHCO3 Kaka杂交杂交 每张片子按所需杂交液为 150μl 计算，其中 SolutionA:SolutionB 为 9:1，即 135μl+15μl 1) Solution A for 30 slides (135μl/slide)： Formamide 2250μl 3M NaCl 450μl 1M Tris-HCl pH 7.5 45μl 0.5M EDTA 9μl 100XDenhardt 45μl 50%Dextran sulfate 900μl H2O 。