设计引物遵循原则、引物保存和各种PCR的引物设计一设计引物应遵循以下原则1、 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右2、 引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb 的片段3、 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过 多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌吟或嘧啶 核苷酸的成串排列上下游引物的GC含量不能相差太大附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值时不算,但在检测互补 和二级结构是要加上它们.引物对的Tm差异不超过5°C，设计时温度 和GC含量是个主要的参数，做复合扩增时更要设计成相近的温度，而 且引物加个尾影响不大但要切记BLAST，包括查阅文献的引物.如果 两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5C,或者为了提高 特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根 据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环4、 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端 的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带引物序列 在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则 容易导致错配。
引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mo l)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不 能正常进行5、 引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配 对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败6、 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜 的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处引物5‘端引入酶 切位点得黏性末端，随意加入3个保护性碱基，但是要注意不要形成引 物二聚体，而且以A或G开头为好7、 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源 性引物量：每条引物的浓度0.1〜lumol或10〜100pmol，以最低引 物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩 增，且可增加引物之间形成二聚体的机会8、 引物酶切：除非产物非常特异，直接酶切PCR产物效果有时不是很 好，还有一般PCR体系里过量的dNTPs会影响酶切效果酶切后，可以 用标准得乙醇沉淀法沉淀酶切产物，获得高纯度得酶切产物，也即是 你的黏性目断片断供后边得试验9、 设计软件： 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DN Astar, Vector NTI, Online desgin et al.二引物保存 定制引物以干粉形式运输。
最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100 mMo TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解引物的稳定性依赖于储存条件应将干粉和溶解的引物储存在-20°C 以大于10mM浓度溶于TE的引物在-20°C可以稳定保存6个月，但在室 温（15C到30C ）仅能保存不到1周干粉引物可以在-20C保存至少1 年，在室温（15C到30C ）最多可以保存2个月三 各种PCR的引物设计1、 长距离PCR：标准PCR的扩增长度在1〜2kb间，不能满足中大型基因的扩增在此背 景下产生了长距离PCR其引物设计原则在标准PCR的基础上还要注意 一下几点：a、长度一般在25〜30bp间；b、两条引物的解链温度趋向相等是非常 重要的如果两条引物的解链温度的差异大于1度，就可能造成错误引 导以及一条链的优势扩增等问题2、 反相PCR：标准PCR应用于已知片断的扩增而反相PCR应用于扩增已知片断相邻 的未知片断，主要应用于a，产生探针；b，从总RNA中克隆未知cDNA序 列；c、研究病毒序列、转基因和转座子的整合点位区域的序列其引物设计除了要注意在模板分子上的设置方向外，其它同标准原则3、 差异显示PCR （DD-PCR）: 次技术的应用在于显示细胞的全部mRNA，通过比较两种细胞或者不同 环境中的同种细胞的cDNA扩增产物的电泳条带谱来鉴定基因表达图谱 的差异。
其引物有两套，一为锚定引物，一为随机引物锚定引物是由12个不 同引物组成的库，序列是5'TTTTTTTTTTTTXY3'其中X可以是AGC中的任 一个，Y可以是ATGC中的任一个随机引物是由15个不同的，长度为10 mer的引物组成它们的序列都是随机形成的，都应改包含几乎相等的 四种单核苷酸，G与C碱基的平衡分布以及具有低自发形成稳定二级结 构的倾向4、 多重PCR:多重PCR就是在PCR中使用一对以上的引物同时扩增目的DNA的几个片断， 以节省模板、节约时间和减少费用引物设计在遵守标准PCR引物设计 的规则外还要保证反应中所有的引物有相近的熔解温度，引物之间不 会发生相互作用，扩增产物大小相近但又能通过电泳分开5、 热启动PCR6、 降落PCR 这两种PCR只是为了满足特别要求，在标准PCR的基础上进行了一些方 法上的改进，而对引物没有什么特殊的要求，按照标准PCR的引物设计 原则即可。