体内临界尺寸骨缺损的临床前1 范围本标准给出了预期修复或再生骨组织植入物骨形成活性的体内临界尺寸骨缺损评价通则；对骨缺损动物模型的制备、骨缺损部位及范围、缺损类型、植入物的制备和评价提供了 相关参数本标准适用于部分临界尺寸骨缺损模型的制备，以及合理利用临界尺寸骨缺损模型对具 有诱导或促进骨生长的骨组织工程医疗产品的测试和评价2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准GB 14925实验动物环境及设施GB/T 16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验 《中华人民共和国药典》（2015版）四部3 术语、定义 下列术语和定义适用于本文件3.1骨再生 bone regeneration生成在组织学，生物化学和力学性能上类似于天然骨组织的骨形成过程3.2骨修复 bone repair通过细胞增殖和新的细胞外基质合成使创伤骨组织愈合的过程3.3密质骨 compact bone是一种骨化的结缔组织，其特征为具有骨单位的板层骨板层骨由高度规则的同心薄板 样结构组成。
3.4皮质骨 cortical bone骨组织的两个主要类型之一皮质骨致密，形成骨的表面3.5临界尺寸缺损 critical size defect (CSD)自然发生的或者是人为制造的一种骨缺损，在没有外界干预的情况下不会愈合在临床上，这个词适用于健康成年人出现缺损后连续观察6个月不愈合的情况3.6骨干 diaphyseal指的是长骨中段3.7软骨内骨化 endochondral ossification骨形成的两种主要类型之一，软骨基质首先形成，随后被骨组织替换注1：脊椎动物的大多骨生长都属于软骨内骨化，特别是长骨注2：骨形成的另一个主要机制为膜内成骨，骨组织直接形成，不需要软骨预先生成；它主要发生 在扁骨（颅骨）的形成中3.8生长板 grow th pla te在长骨的骺区里，是软骨内成骨生长区注：在骨骼发育成熟的动物中生长板是融合的3.9长骨 long bone它的长度大于宽度，主要通过骨干的延伸生长长骨包括股骨、胫骨、腓骨、肱骨、桡 骨、尺骨、掌骨、指骨、跖骨、趾骨3.10骨髓 marrow骨髓腔里填充的红色或黄色的柔软胶状组织，颜色取决于造血组织占优势（红色）还是 脂肪组织占优势（黄色）。
注：红骨髓也被称为骨髓组织3.11基质mat rix本标准中，基质可指外源性植入支架或来自宿主的内源性细胞外物质（也称为细胞外基 质）3.12干骺端 metaphyseal附属于长骨致密的末端3.13重塑 remodeling指旧骨从骨骼上移走（骨吸收），且新骨增加（骨形成）的伴随终生的过程3.14残留时间 residence time材料（合成的或天然的）从植入宿主组织到不能从宿主组织检测到的时间3.15骨成熟期 skeletal maturity骺板融合的年龄注：在啮齿动物中，骨骼发育成熟的动物特征是有成熟的生殖腺3.16松质骨 trabecular bone以骨髓包围针状骨为特征的骨化的骨结缔组织3.17负重与非负重模型 weigh t-bearing versus non-weigh t bearing models负重是指作用于患者或实验动物手术腿上的重量，通常以体重的百分比描述注1：非负重意味着腿不能接触地面（即，支持0%的体重） 注2：完全负重意味着腿在迈出一步的时候可以承受身体100 %的体重4 动物模型4.1 概述本部分描述了用于确定动物模型，骨缺损位置和尺寸的选项,详细参见附录A。
给出了选 择大鼠和兔子模型的考虑其他动物模型的考虑可参见附录A使用这些动物模型进行研究时应遵守国家对实验动物护理和使用的管理规定，在实验前 要通过实验动物护理和使用机构的检查和批准（必要时可咨询兽医师后制定研究计划）4.2 缺损尺寸4.2.1 大部分人类骨折的部位发生在长骨，因此，在动物模型中一般采用长骨缺损模型来 评价骨修复/再生骨修复的临界尺寸缺损评估常见动物模型参数参见附录A4.2.2 原则上讲，临界尺寸缺损可位于两个干骺端和骨干的位置本文件只描述长骨骨干 部的缺损4.2.3 关于缺损尺寸和动物的体重、解剖结构、步态等方面在动物种属之间存在明显差异， 因此对骨缺损有动力学、运动范围和力学等方面的影响这些因素影响骨的构造和结构，在 对骨损伤或疾病的反应中发挥了重要作用使用者应该谨慎考虑动物模型是否适合于植入TEMPs的研究阶段4.2.4 力学载荷能影响骨修复在所有力学生物学因素中，间歇静水压力和载荷应力在调 节骨发育和维持、以及退化中起重要作用力学载荷强度或持续时间对植入TEMPs以及周围 天然骨的影响依据解剖部位不同而变化所以，选择评估植入效果的缺损部位时应考虑到力 学载荷对植入物性能的影响。
4.2.5 建议选择适当的动物种属和解剖部位要具有足够大的尺寸，能充分研究和优化设 想为人使用的植入物配方、设计、尺寸等，特别是在开发产品的后期4.2.6 较大的动物可能更适于骨缺损修复的研究，特别是在与人相近的解剖部位4.2.7 较大的骨缺损一般需要一种固定方法来固定植入物，以减少植入物脱位固定植入 物的方法会对周围的宿主组织和修复组织产生不利影响因此，以不需要固定的TEMPs模型 实验结果来预测需要固定的较大动物模型和人的结果时，需要考虑这个因素带来的差异4.2.8 对于每个种属，临界尺寸缺损被定义为该动物在不经治疗的情况下，不能修复的最 小尺寸临界缺损尺寸因动物种属不同而不同，当设计植入物尺寸和固定方法时，应认真考 虑作为一个经验法则，骨缺损（由骨切除形成）的长度至少应等于所选骨直径的1.5倍 一些学者建议至少是所选骨直径的 2 倍4.2.9 骨切除段的骨膜是否保留会影响骨缺损的愈合在多数的临界尺寸骨缺损研究中， 骨膜都被切除在报告结果时，应说明骨膜是否切除4.2.10 每个研究应包括一个空白的缺损对照组，以证实该模型是一个临界尺寸的缺损如 果模型非常成熟，为节省动物数量，宜考虑使用历史数据，而不是实际对照动物，除非这不 利于研究的目标。
例如，在关键的临床前概念验证研究中，同步对照可能是适当的4.2.11 通常建议采用单侧缺损模型尤其对于使用四肢进行负重（尤其是山羊，绵羊和马） 动物的负重位置4.3 力学影响因素4.3.1 由于跳跃或跑步而使植入物受极端和高度变化的力学影响，会增加观测结果差异4.3.2 应仔细考虑使用负重和非负重模型对结果带来的潜在差异4.4 染色体性别4.4.1 由于循环类固醇对软骨和骨的代谢及再生的影响，染色体性别的选择应该加以考虑 不能使用在哺乳期的动物为了某些目的，采用年龄较大或卵巢切除的雌性（特别是大鼠）， 可用于模拟骨质疏松的情况4.4.2 建议在同一组实验中使用相同的性染色体动物，并且需要在报告中说明研究者应 该意识到性别间可能存在差异，需要适当的统计学分析4.5 年龄4.5.1 骨生长过程经历代谢的动态变化和重塑由于这些生理过程对组织修复的影响，宜 使用骨发育成熟的动物实验组动物的骨骺生长板宜已经融合如有必要可通过X线平片摄 影判断不同种属动物间的骨成熟差异4.5.2 年长的动物有骨量减少的倾向，并且骨缺损修复能力下降如果认为特定条件对 TEMPs 的评估是重要的，应该使用一个相适应的模型。
4.5.3 间充质干细胞池、对生长因子的响应性和细胞的代谢活动一般随年龄增长而下降 因此，依赖于自身细胞数量和活性的修复过程，在年长动物中可能会受影响4.6 饮食或并发症在一般情况下，采用正常饲养条件下的健康动物进行研究然而，也有通过添加氟化物， 以及禁止摄入维生素D和/或钙等方法制作具有骨病的动物模型在考虑伴有影响骨修复的系 统性疾病患者治疗时，考虑使用模拟该疾病或条件的非临床模型是适当的4.7 研究期限4.7.1研究的时间长短取决于TEMPs的开发阶段，使用的动物种属，缺损的大小，植入物 的组成和设计4.7.2大鼠和兔子的小缺损模型，植入8周〜12周即可提供植入物停留时间，TEMPs的固 定以及修复类型的相关信息4.7.3 使用较大的动物（狗、绵羊、山羊），8周 12周的研究周期对于获得缺损内植入 物的生物相容性，细胞的早期反应，植入物存留状态和条件等信息是有限的4.7.4 基于组织学观察结果判断成功修复骨缺损和骨重建，需要超过3 个月的研究周期4.7.5 根据不同的研究目的，建议在缺损完全愈合之前对一个或多个组进行评价当将一 种新材料和标准材料（如自体骨）进行比较时，两组之间的差异可能在早期最大，之后随时 间延长而消失。
一般而言，需要通过统计学分析来比较研究的结果4.8 动物数量每组使用的动物数量需要满足统计学分析的要求所需动物数量取决于所用动物间的差 异、手术治疗的一致性、评价方法的准确性、实验过程中预期的动物损耗率以及分析数据的 统计学方法另一个重要因素可能是研究目的（例如，比较空白缺损组或不同植入物组的可 行性和效果）、和治疗的差异性（例如，加入细胞/生长因子，植入物的尺寸）如果各组 模型已经建立完善（源于文献或预实验结果），那么试验所需实验动物的数量可从现有的数 据中查询试验研究表明，利用组织学和力学性能方法评价的试验中，每组6只〜8只动物是 合适的文献中所记载的每组动物的数目，参见附剥4.9 动物种属4.9.1 大鼠模型4.9.1.1 大鼠是开发早期最常用的试验动物，因为其价格低廉，饲养空间较小以及容易饲养 最常使用的模型是股骨缺损模型4.9.1.2由于股骨是负重部位，其缺损必须通过内固定或外固定使其稳固由于动物的尺寸 偏小，其固定系统一般需要定制可使用螺钉、克氏针或者环扎术固定板材（聚合物或金属） 作为固定系统4.9.1.3典型的缺损尺寸是5 mm，可使用锯或牙科钻切除骨干中部在切除中要注意不要损 伤坐骨神经，术后腿的废用将延迟缺损的愈合时间。
要了解更多细节，请参见附录A4.9.2 兔子模型4.9.2.1 相对于大型动物（狗，绵羊或山羊）来说，兔子作为试验对象是很经济的4.9.2.2 相对于其它骨缺损评价所使用的种属而言，兔子的皮质骨厚度较薄4.9.2.3 由于兔桡骨是管状的，更适宜采用影像学、组织学和力学方法进行评价4.9.2.4 尺骨或桡骨的临界尺寸缺损模型无需固定，因为另一块骨可以起到稳定作用4.9.2.5 典型的缺损尺寸是15 mm 20 mm注：一些研究中指出15 mm的缺损可能是不够大的4.9.2.6试验一般选择生长板闭合的成年兔（大约20周龄）在年轻的动物中，如果手术 腿中的完整骨可能过度负重，将导致生长板滑动而被排除出试验组4.9.2.7 如果力学性能测试是结果分析之一，那么兔尺骨模型是有一定风险的，因为桡骨易 于附着在缺损部位（融合）扭转试验的旋转轴很难重复，横截面积也难以测量5 缺损部位5.1本标准重点关注长骨的骨干中部节段性缺损CSD模型举例参见附录B5.2 建立典型骨干骨缺损模型的骨包括尺骨、桡骨、胫骨、腓骨和股骨但不是所有动物 各部位缺损都有报道5.3 注意事项也应包括在实施外科手术和固定时的难易程度。
5.4 临界尺寸节段性骨缺损对称模型通常被认为是不可。