实验 蛋白质的沉淀反应与颜色反应一、实验目的掌握鉴定蛋白质的原理和方法熟悉蛋白质的沉淀反应，进一步 熟悉蛋白质的有关反应二、实验原理蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色不同 的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同颜 色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色 反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质另 外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据蛋白质是亲 水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但 其稳定性是有条件的，相对的如果条件发生了变化，破坏了蛋白质 的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来三、实验仪器1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH 试纸 6、水浴 锅 7、移液管四、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4 层纱布过滤， 滤液放在冰箱里冷藏备用2、0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml3、 Millon's试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶 解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用此试剂可 长期保存4、 尿素晶体5、 1%CuSO ： 1g CuSO 晶体溶于蒸馏水，稀释至 100ml446、 10%NaOH： 10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml7、 浓硝酸8、 0.1%茚三酮溶液： 0.1g 茚三酮溶于 95%的乙醇并稀释至 100ml.9、 冰醋酸10、 浓硫酸11、 饱和硫酸铵溶液： 100ml 蒸馏水中加硫酸铵至饱和。
12、 硫酸铵晶体：用研钵研成碎末13、 95%乙醇14、 醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml15、 氯化钠晶体16、 10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至 100ml17、 饱和苦味酸溶液： 100ml 蒸馏水中加苦味酸至饱和18、 1%醋酸溶液五、实验步骤 蛋白质的颜色反应（一） 米伦（Millon's）反应1、苯酚实验：取 0.5%苯酚溶液 1ml 于试管中，加 Millon's 试剂0.5ml，电炉小心加热观察颜色变化2、蛋白质实验：取2ml蛋白液，加Millon's试剂0.5ml,出现白 色的蛋白质沉淀，小心加热，观察现象二） 双缩脲反应1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热熔化，至重新 结晶时冷却然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4 溶液，混匀，观察现象2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察现象三） 黄色反应取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴加热，冷却后注意 颜色变化然后再加入10%NaOH溶液1ml,观察颜色有什么变化四） 茚三酮反应取蛋白液1ml于试管中，加4-8滴茚三酮溶液，加热至沸，即有 蓝紫色出现。
蛋白质的沉淀（一）蛋白质的盐析作用1、试管中加蒸馏水3ml，加固体硫酸铵至饱和另一支试管加 蛋白液2ml，再加入饱和硫酸铵溶液2ml，摇匀静置观察现象2、将上述混合液过滤向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵，直 至饱和为止，此时析出为清蛋白再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否 溶解二）有机溶剂沉淀蛋白质试管中加蛋白液1ml,加晶体氯化钠少许，溶解后加95%乙醇3ml, 摇匀，观察现象三） 重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质1、 取试管2支，各加蛋白液2ml, 一支管中滴加1%醋酸铅溶液， 另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生2、 取一支试管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混 匀，观察结果四） 生物碱试剂沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸数 滴，观察现象六、实验结果蛋白质的颜色反应（一） 米伦（Millon's）反应1、苯酚实验： 溶液即出现玫瑰红色2、蛋白质实验：出现白色的蛋白质沉淀，小心加热后凝固的蛋白质出现红色二） 双缩脲反应1、有紫色出现2、溶液有蓝紫色出现（三） 黄色反应先有黄色沉淀生成，加入 10%NaOH 溶液 1ml 后颜色变为橘黄色。
四） 茚三酮反应有蓝紫色出现蛋白质的沉淀（一）蛋白质的盐析作用1、有蛋白析出2、有蛋白质析出，加水后可复溶六）有机溶剂沉淀蛋白质取一试管加蛋白液1ml,，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象（七） 重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液, 另一支管中滴加 1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生八） 生物碱试剂沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸和 鞣酸数滴，观察现象七、 实验分析蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色不 同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同 其中米伦试剂能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应，而组成蛋 白质的氨基酸中酪氨酸含苯酚基团，因此可用米伦试剂检测蛋白质中 酪氨酸的存在尿素被加热，形成双缩脲，在碱性环境中，能与硫酸 铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应蛋白质分子中含有 肽键与缩脲结构相似，也能进行此反应蛋白质分子中含有苯环结构 的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质， 此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物硝醌酸等。
蛋白质与 茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物此反 应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸） 与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水 化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的如果条件发生了变化， 破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来向蛋白质中 加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗 粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相 反电荷的离子所中和于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀盐析 作用一般不使蛋白质变性某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等）， 因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相 互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀重金属离子（如 Pb2+、Cu2+ 等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白 质发生变性某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀 植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱能沉淀生 物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸等当溶液 PH 小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离 子发生反应而沉淀。
蛋白质变性(proteind enaturation) 是指蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性 质的改变和生物活性的丧失一般认为蛋白质的二级结构和三级结构 有了改变或遭到破坏，都是变性的结果能使蛋白质变性的化学方法 有加强酸、强碱、重金属盐、尿素、乙醇、丙酮等；能使蛋白质变性 的物理方法有加热(高温)、紫外线及 X 射线照射、超声波、剧烈振荡 或搅拌等如果变性条件剧烈持久，蛋白质的变性是不可逆的如果变性条 件不剧烈，这种变性作用是可逆的这时，如果除去变性因素，在适 当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋 白质复性(renaturation)例如胃蛋白酶加热至80~90°C时，失去 溶解性，也无消化蛋白质的能力，如将温度再降低到37C，则又可 恢复溶解性和消化蛋白质的能力蛋白质变性的应用价值医学：临床上的消毒和灭菌---使病原微生物变性注射及外伤采用 75%乙醇灭菌手术器械及其它用品采用高温高压灭菌手术室用紫外线灭菌用热凝法检查尿蛋白实验室：防止蛋白质变性：在生产和保存激素、酶、抗体血清等具有生物 活性的蛋白质(如酶、疫苗、免疫血清等)时，应防止其变性失活， 其中在低温条件下生产与贮存以上蛋白质就是这个道理。
实验室的灭菌：细胞培养室等亦用紫外线照射消毒灭菌 日常生活：熟食较生食易消化：因为蛋白质变性后，肽链构象由卷曲变为伸展， 使肽健暴露，易被蛋白水解酶消化水解其中盐析法作为一种蛋白质胶体简便的提取手段被广泛应用于 工业生产盐析法是在中药水提液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状 态,使某些成分在水中溶解度降低,从而与水溶性大的杂质分离如向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐[如(NH4)2S04或Na2S04] 溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析 这样析出的蛋白质仍可以溶解在水中，而不影响原来蛋白质的性质 因此，盐析是一个可逆的过程利用这个性质，可以采用多次盐析的 方法来分离、提纯蛋白质蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的 水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜 的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的蛋白质溶液中加入中 性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子 周围的水化层减弱乃至消失同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离 子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶 解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
由于各种蛋白质在不同盐 浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而 使之从其他蛋白中分离出来简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化 钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏， 导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀盐析法简单方便，可用于蛋白质抗原的粗提、丙种球蛋白的提取、 蛋白质的浓缩等但盐析法提纯的抗原浓度不高，只能用于抗原的初 步纯化目前盐析法应用于免疫球蛋白和酶提取、分离纯化、浓缩等 和中药的提取。