PCR 引物设计流程（以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例）一． 流程图二． 确定模板1.确定模板来源物种近亲物种 ：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等常用物种 ：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊 狗），爬行类（鳄，龟），两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼） 一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择 2 种以上作为模板如 扩增鹅PHIP基因选择以下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑 马鱼2. 利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列A.进入NCBI主页 ，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得到如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都可使用）Search[g]PHIP[Sym[r>捜索范围JavS 5S3rcn Advanced关键词Displgi^ Jottings■: M Tabular, 20 per page. Sorted by Relevance搜索结果Results: 1 to 20 of14£> 结果数riIters: P/lanaqe Filters 树状图clearPage 1of 8Nesd pLast fO Filters activatec Current oil/ Clear all to show 147 items.VTaxoionic Groups基圉别名□ FHIF3ID:55023DescriptionLocationAliasespleckstrn hnmr.ing'./ Hnmaip interactinq protein^pbino 讯pie门s (human^^Chromosome 6NC 003006 12(78934419 79078294BRWD2. LCAF14WDR11, ndrpName/Gene IDMM612870物种名complement）基因定位信息0 PhipID:03946pleckstrn hom&logv damain irteractirg protein [伽selisMus (house mouse)]Chromosome 9 f'-lC_000075.E(B2B66159.82975700 complement}28J0004D21Rik,46324MOOGRik,Ndrp, Wdr110 PhhID： 315843pleckstrn hom&log^ damain irteractirg protein [Raders rrorveg治ws [Norway ratj]Chromosome 8. f'-JC_C05107.4 [90337339 .90433964. complement}RGD15649640 £hi£ID:569727pleckstrin homology domain interacting protein [Diar/o rario (zebrafish)]Chromosome 23,NC_007134.G(31349444 3U2OD72complement}brwjl im.n4roiO si:ckey-2G1l7.3vertebrates (146) mamina s (&8)pa centals (84) irarsupials (3) m¬yrneg (1) birds (40)Passe ifonnes (1&) Falconifonne& (4) GruiformeE (3) Pelecaitformes (3) Psittaciformes (2} Galliformes (2) Sphenisciformes \2) more... (14) bon/ fishes (8)C/'prinodan亡弓(2) more... (6)turtles {3) lizsrd^ (2) Crocodylia (2) amphibians (1) cartitioinous fishes ⑴ coelacanths (1)B・点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。
基因报告页面中部Refseq条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考 亠 NCBI Reference Sequences （RefSeq）田RwfSEQS nnEiintairwti indEPEn血ntly of Annotatfid臨血皿臂 独立于注释基因组的参考序列，具有数据库来源，多为实验扩增所得’可靠性高 E RefSEQS of Annotated GEnomE5： Homo sapiEn弓Annotation血1歸盟伽 来源于注释 基因组的参考■序列，为计算机预测所得』可靠性较低C.需注意：对于同一基因的mRNA可能具有不同长度的剪切异构体，选择模板时不同物种应尽量选择同一异构体（一般选择最长的异构体）PREDICTED: Mus musculus pleckstrin homology domain interacting protein （Phip）, transcript|variant X"lj mRNANCBI Reference Sequence XM_C1O6511564.2FASTA GraphicsD. 如需得到该基因所在基因组的序列信息（如扩增启动子区域时），在基因报告页面上部 Genomic regions，transcripts, and products条目下，点击Go to nucleotide选项下FASTA按钮可进入基因组（组装）序列页面。
Genomic regions, transcripts, and products * ?Go to「EfewriB 血tsiibGenomic Sequence: NC_000006.12 chromosome 6 reference GRCh38 Primary Assembly 日Go to nucleotide: Gmphics | FAWTA. | Gen曲ikE.在基因组（组装）序列页面中，默认仅显示跳转前基因的序列，在Change region show条目中修改设Change region shown "O Whole seqMence® Selected regionfrorirti： 7803^1419 lo: |?9078294UpdatoViGwl置为 Whole sequence 得到基因组序列，在 Send 选项下保存即可Display WortingE： A FASTAHomo sapiens chromosome 6, GRCh38 Primary Assemblyncbi Reference sequence. NC_000006.12Gwn 日 mrik G『zphi 陽>gi | 5688155!?2: c790782y4-73934-d 19 Him口 sapiens DhramosorLS 6j GECh38 Primary Assejubly3. 整理下载的模板序列Chicken XM_003540997.2.txt保存模板时，记录物种名，同时在命名 DuckXMM5017&6ft,l.txt中添加NCBI登录号便于以后查找 Human NM_017934.5.txtIVlus musculus NM_001OS121 &. 1 .txtPHIP.toct 銀件i Xenopus tropicalis XM_00293620&,2,t„,Zebrish XMJ>09297{KM.l,txt文件阴编辑（E）梧式〔口l苣看閃釋助（H）》名称1ATGC...（序列 1）〉名称2ATGC...（序列力以此类推□序列嵬X -记事本文件旳輛（目梧式査看⑷帮助（H）>Chicken [Gallus galius]atggg gaggaaaaagat ccagat ccagcggatc 呂 egg 呂 1: gagcg ctt gatgaagaaagcctacgagctgagcgtgttgtgcgactgcg tgttccagtat gccagcaccgacatggacaaggtgctgcttaag三． 寻找保守区域保守区域的意义：基因的保守区域是指不同来源的同一个基因在某些区域没有差别或者差别很小。
在扩增基 因序列时，选择在保守区域设计引物能够更有效的扩增未知的基因因此，在引物设计前需先找出目的序列 中的保守区域在引物设计时，则首先应在保守区域内设计引物1. 制作 mega 标准序列A.用ClustalX软件打开整理好的TXT文件（菜单File —Load Sequences）,然后在菜单Alignment选项下选择Do Complement Alignment,此时将保存两种格式文件:.dnd和.aln（序列较长时耗时较长，需数分钟）H ClustalX (1.83)File Edit Alignment Trees Colors Quality HelpMultiple Alignment Mode TChickenHuirLanMouseRat [RattiasFont Size: 1 0 二ATGGGATGGG ATGGGATGGG ATGGG匚口rr 引"亡 A ignmentCattleOutput Guide Tree File:Output Alignment Files:.将以上.aln文件用DAMBE软件打开(File^Open standard sequence file),注意选择恰当的序列类型。
打 开后的文件可直接转存为.meg或.fas格式文件(File—Save or Convert Sequence Format)注1：此时在Sequence Info对话框应选择Binary选项，否则在转换格式时T碱基会被替换为UPHIP.FASPearson/FASTA[*.FASJPAML C*.P-ML)GenEank (*.GE)GCG single sequence format C*.GCG)GCG multiple sequence-formatPHYLIPEMBL/SwissProtD-NA Strid&rFitch C*.Fit]PIR/CODATA 仁PIR)PAUP/NEXUS (*.NEX)ME卧 r.NER)Kumar's PHVLTEST (*SK]NEXML2. Mega 分析同源性A.用Mega软件打开以上保存的.meg或.fas格式文件，新建一个序列对齐分析窗口(Align—Edit/BuildAlignment—Retrieve sequences from a file)B.在新窗口中以默认设置将序列集进行序列对齐分析(Alignment—Align by muscle (Codons)),结果保存为.fas 文件(Data —Export Alignment)。
53 M5: Alignment Explorer (PHIP5.M。