11０１ 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典规定无菌的药物、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其她品种与否无菌的一种措施若供试品符合无菌检查法的规定，仅表白了供试品在该检查条件下未发现微生物污染无菌检查应在无菌条件下进行，实验环境必须达到无菌检查的规定,检查全过程应严格遵守无菌操作，避免微生物污染，避免污染的措施不得影响供试品中微生物的检出单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业干净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试措施的现行国标进行干净度确认隔离系统应定期按有关的规定进行验证,其内部环境的干净度须符合无菌检查的规定平常检查还需对实验环境进行监控培养基硫乙醇酸盐流体培养基重要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养;胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养培养基的制备及培养条件培养基可按如下处方制备,亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌制备好的培养基应保存在2~25℃、避光的环境,若保存于非封闭容器中,一般在3周内使用;若保存于密闭容器中,一般可在一年内使用１. 硫乙醇酸盐流体培养基胰酪胨 15.0g氯化钠 ２．5ｇ酵母浸出粉 ５.0ｇ新配制的0.１％ 刃天青溶液 1.０ml 无水葡萄糖 5．０ｇ琼脂 0.75gL-胱氨酸 0.5g 水 1000mｌ硫乙醇酸钠 0.5g(或硫乙醇酸) (0.3ml)除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合,微温溶解,调节pH为弱碱性,煮沸,滤清,加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节ｐH,使灭菌后在2５℃ 的ｐH值为7.１±０.2。
分装至合适的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色)不超过培养基深度的1/2在供试品接种前,培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1／5,否则，须经1０0℃水浴加热至粉红色消失(不超过２０分钟),迅速冷却，只限加热一次，并避免污染除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃ 培养2． 胰酪大豆胨液体培养基胰酪胨 １7.０g氯化钠 5.0g大豆木瓜蛋白酶水解物 3．0g磷酸氢二钾 2．５ｇ葡萄糖／无水葡萄糖 ２.5ｇ/2.３g水 1０00ml除葡萄糖外,取上述成分,混合，微温溶解，滤过，调节pＨ使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0．２,加入葡萄糖，分装，灭菌胰酪大豆胨液体培养基置20~2５℃培养3． 中和或灭活用培养基按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法,在培养基灭菌或使用前加入合适的中和剂、灭活剂或表面活性剂,其用量同措施合用性实验4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查)胨 10.0ｇ氯化钠 5.0g牛肉浸出粉 3.0g水 1000mｌ葡萄糖 5.0g除葡萄糖外,取上述成分混合，微温溶解,调节pＨ为弱碱性,煮沸，加入葡萄糖溶解后,摇匀，滤清,调节ｐＨ使灭菌后在25℃ 的pH值为７.2±0.2，分装,灭菌。
5. 胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪胨 15.0g琼脂 15．0g大豆木瓜蛋白酶水解物 5.0g水 10０0ml氯化钠 5．0ｇ除琼脂外,取上述成分,混合，微温溶解,调节ｐH使灭菌后在25℃ 的pH值为7.３±0.2,加入琼脂,加热溶化后，摇匀,分装，灭菌6. 沙氏葡萄糖液体培养基动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 １０.0g水 1０00ml葡萄糖 ２０.0ｇ除葡萄糖外,取上述成分，混合,微温溶解,调节ｐＨ使灭菌后在2５℃ 的pＨ值为5．6±0.2,加入葡萄糖，摇匀，分装,灭菌7. 沙氏葡萄糖琼脂培养基动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 １0．0g琼脂 15.0g葡萄糖 ４0．0g水 1０0０ml除葡萄糖、琼脂外,取上述成分,混合，微温溶解,调节ｐH使灭菌后在2５℃ pＨ值为5.６±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。
培养基的合用性检查无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及敏捷度检查规定本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同步进行无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定的温度培养1４天,应无菌生长敏捷度检查菌种 培养基敏捷度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代)，并采用合适的菌种保存技术进行保存,以保证明验菌株的生物学特性金黄色葡萄球菌(Staphyｌococｃus）〔CＭＣC（B)２6 ０03〕铜绿假单胞菌(Pseudoｍonas ａerｕgｉnosa）〔CMCC(B)10 104〕枯草芽孢杆菌(Bacｉlｌus subtｉliｓ)〔CMCC(B）63 501〕生孢梭菌(Clｏstridium ｓｐoroｇenes)〔CＭCC（F）6４ 9４1〕白色念珠菌（Candｉda ａlｂiｃａns)〔ＣMＣC（F）98 0０１〕黑曲霉(Aspergiｌlus nigeｒ）〔CMCC（Ｆ）９8 0０３〕菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上,接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30～35℃ 培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，２０～２5℃ 培养24~4８小时,上述培养物用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9% 无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数不不小于１00cfu(菌落形成单位）的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上,２0～25℃ 培养5~7天,加入３～5ml含0.0５% （ml/ml) 聚山梨酯8０的ｐH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱然后，采用合适的措施吸出孢子悬液至无菌试管中,用含0.0５％ （ｍl／mｌ）聚山梨酯8０的pH７.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或０.9% 无菌氯化钠溶液制成每1ｍl 含孢子数不不小于100cfu的孢子悬液菌悬液若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2~8℃ 可在24小时内使用黑曲霉孢子悬液可保存在２～8℃ ,在验证过的贮存期内使用培养基接种 取每管装量为12ｍl 的硫乙醇酸盐流体培养基7支,分别接种不不小于１0０cfｕ的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照,培养3天；取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基７支,分别接种不不小于1０0cｆu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各２支,另１支不接种作为空白对照,培养5天逐日观测成果成果鉴定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好,判该培养基的敏捷度检查符合规定稀释液、冲洗液及其制备措施稀释液、冲洗液配备后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
１. 0.1%无菌蛋白胨水溶液 取蛋白胨１．0g,加水１0０0ml，微温溶解，滤清，调节pH至7．１±0．2,分装,灭菌2. pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾3.５6g，无水磷酸氢二钠5.７7g，氯化钠4.3０g,蛋白胨1.00g,加水1０0０ml，微温溶解，滤清,分装，灭菌根据供试品的特性,可选用其她经验证过的合适的溶液作为稀释液、冲洗液(如0.9% 无菌氯化钠溶液)如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等措施合用性实验进行产品无菌检查时，应进行措施合用性实验,以确认所采用的措施适合于该产品的无菌检查若检查程序或产品发生变化也许影响检查成果时,应重新进行措施合用性实验措施合用性实验按“供试品的无菌检查”的规定及下列规定进行操作对每一实验菌应逐个进行措施确认菌种及菌液制备 除大肠埃希菌（Ｅsｃheriｃhia coli）〔CＭCC(B)44 １０2〕外,金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制备同培养基敏捷度检查大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌薄膜过滤法 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入不不小于100cfu的实验菌,过滤。
加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内另取一装有同体积培养基的容器,加入等量实验菌，作为对照置规定温度培养，培养时间不得超过5天，各实验菌同法操作直接接种法 取符合直接接种法培养基用量规定的硫乙醇酸盐流体培养基6管，分别接入不不小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接种法培养基用量规定的胰酪大豆胨液体培养基6管,分别接入不不小于1０0cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量,另1管作为对照，置规定的温度培养，培养时间不得超过５天成果鉴定 与对照管比较，如含供试品各容器中的实验菌均生长良好，则阐明供试品的该检查量在该检查条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽视不计，照此检查措施和检查条件进行供试品的无菌检查如含供试品的任一容器中的实验菌生长单薄、缓慢或不生长，则阐明供试品的该检查量在该检查条件下有抑菌作用,应采用增长冲洗量、增长培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等措施,消除供试品的抑菌作用，并重新进行措施合用性实验措施合用性实验也可与供试品的无菌检查同步进行供试品的无菌检查无菌检查法涉及薄膜过滤法和直接接种法。
只要供试品性质容许,应采用薄膜过滤法供试品无菌检查所采用的检查措施和检查条件应与措施合用性实验确认的措施相似无菌实验过程中,若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性检查数量 检查数量是指一次实验所用供试品最小包装容器的数量,成品每亚批均应进行无菌检查除另有规定外，出厂产品按表1规定;上市产品监督检查按表２规定表1、表２中至少检查数量不涉及阳性对照实验的供试品用量检查量 是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量(g或ml)除另有规定外,供试品检查量按表３规定若每支（瓶)供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基采用薄膜过滤法时,只要供试品特性容许,应将所。