用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸外切酶核酸修饰酶第三讲 基因工程的酶学基础单链DNA内切酶基因工程原理纲要第一讲 基因工程概论第二讲 基因工程的主要技术第三讲 基因工程的酶学基础第四讲 基因克隆的载体与受体第五讲 目的基因的分离与克隆第六讲 克隆基因的检测与鉴定第七讲 基因表达调节与产物纯化第八讲 从原核到真核基因工程质粒载体噬菌体载体大分子DNA克隆载体基因打靶载体病毒载体第四讲 基因克隆的载体与受体用于基因转移的受体菌或细胞在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体1. 载体 (Vectors)（1）在宿主细胞内能独立复制 （2）有选择性标记3）有一段多克隆位点2. 基因工程对载体的要求外源DNA插入其中不影响载体的复制4）分子量小，拷贝数多 （5）容易从宿主细胞中分离纯化基因工程中常用的载体有5类： 3. 载体的种类质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus） 第一节 质粒载体 一、质粒（plasmid ） 是独立于染色体以外的能自主复制的双链 闭合环状DNA分子。
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中大肠杆菌的质粒（1）分子小： 1. 质粒的一般生物学特性1—200 kb（2）编码基因少： 2—3个中等大小的蛋白质 （3）环形状：双链环状DNA酵母的“杀伤质粒”是RNA）如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些 额外的特性（非必须）4）质粒的空间构型：① 共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（super coil）Covalent close circular DNA③ 线形DNA （ linear ，lDNA）一条链上有一至数个缺口② 开环DNA（ open circular， ocDNA）（5）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳 迁移率不同：scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢SCOC L二、质粒的类型在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 接合型质粒:非接合型质粒能自我转移不能自我转移除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有 一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因如：F质粒（性质粒、或F因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到 原先不存在该质粒的受体菌中又叫自我转移型质粒1. 接合型质粒：不符合基因工程的安全要求。
大肠杆菌接合（conjunction）2. 非接合型质粒：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控 制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一 个细胞转移到另一个细胞1）R质粒（抗性质粒）：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样 的抗生素抗性性状（resistance）符合基因工程的安全要求带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因 2）Col质粒：大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以 成为接合型质粒三、质粒的复制类型1. 严紧型质粒（stringent plasmid）拷贝数少，只有1—3份拷贝2. 松弛型质粒（relaxed plasmid）拷贝数多，有10—60份拷贝接合型质粒分子量大，一般属严紧型）非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）1）分子量大，拷贝数低四、质粒载体的构建1. 天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101， 分子长 9.1 kb但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）2）筛选标志不理想可以通过插入失活筛选。
但细菌群体容易自 发突变出抗colicin E1的细胞…….colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成 “噬菌斑”唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部ColE1（1） 具有复制起点（ORI）2. 质粒载体必须具备的基本条件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性内切酶的单一位点：是筛选的标志理想的载体应该有两种抗 菌素抗性基因用来插入外源DNA片断且插入后不影响复 制功能4）具有较小的分子量和较高的拷贝数 氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）3. 质粒的选择标记及其工作原理：（1）选择标记①① 抗菌素抗性抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记 ：常用抗菌素的抗性工作原理常用抗菌素的抗性工作原理i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp） 青霉素的衍生物通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应， 杀死生长的细菌a）抑菌原理b）细菌抗性原理Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割 氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成杀死生长的细菌b）细菌抗性原理Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活a）抑菌原理a）杀菌原理iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错 读杀死细菌b）细菌抗性原理Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用iv）链霉素（Streptomycin，Str）a）杀菌原理通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错 译杀死细菌b）细菌抗性原理Strr 编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素 进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作 用v）四环素（Tetracycline，Tet）b）细菌抗性原理a）抑菌原理通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白 质的合成并阻止肽键的形成杀死生长的细 菌Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进 行修饰，阻止四环素通过细胞膜进入细菌细 胞内②② 遗传标记遗传标记使受体菌发生遗传性状的改变的基因当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后， 受体菌才能生长不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗 菌素的培养基（选择培养基）中生长。
2）抗菌素选择原理活死抗性基因抗菌素4. 4. 人工构建的质粒载体的类型人工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点 而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制 ，达到每个细胞的拷贝数1000—3000个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的 基因产物2）低拷贝数的质粒载体但有特殊用途:由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地 影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时 ，就需要低拷贝的载体pLG338、pLG339、pHSG415等不适合大量扩增DNA用3）失控的质粒载体这是一类温度敏感型复制控制质粒温度低（低于37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC）时，拷贝数会很快增加到1000个以上如pBEU1、pBEU2runaway plasmid vectors1979年B. E. Uhlin等构建4） 插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基 因内部如pDF41、pDF42、pBR329抗菌素抗性外源DNA无抗菌素抗性（（5 5））正选择的质粒载体如pUR2、pTR262等。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选 择培养基上生长直接选择转化后的细胞目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择 载体Direct selection vectors（6） 表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核 生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下注意启动子的性质，终止子、起始密码 、终止密码的阅读正确复制起始点ORI 选择标记 多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区1）普通载体元件① 表达载体的结构五、经典的大肠杆菌质粒载体1. pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体 1）类型天然质粒，属低拷贝型2）长度9.09 kb（3）选择标记四环素抗性Tetr6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、 BamH I、Sal I 主要使用EcoR I其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位于选择 标记Tetr的内部）（4）克隆位点2. ColE1（1）类型天然质粒，属高拷贝型2）长度6.3 kb。
3）选择标记大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质 合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000- 3000拷贝之多！① colicin E1基因的结构ceaimmkil结构基因免疫基因溶菌基因② 杀死不含有ColE1细菌的原因cea + kil基因产物③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因imm基因EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1 失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍 然表现出对E1免疫型（ImmE1+）EcoR I（4）克隆位点Colicin E1外源DNA无Colicin用对外源colicin E1的免疫性和自身不能合成 colicin E1作选择，操作非常繁杂 对colicin E1敏感的细菌群体中自发突变产生 抗colicin E1的频率很高！（5）ColE1的选择缺陷ColE1抗 colicinE1杀ColE1-仍抗 colicinE1不杀ColE1-插入片断ColE1pSP2124质粒的Ampr基因3. pBR322（1）元件来源F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。
① 复制起点 ori pMB1系列（来源于ColE1）的高 拷贝型复制起点② Ampr基因③ Tetr基因 pSC101的Tetr 基因2）长度4363bp（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性4）克隆位点其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I 、Hind Ⅲ、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、 Pst I）24个克隆位点5）pBR322的优点① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡外源基因BamH IAmp中存活但在Tet中死亡外源基因Pst ITet中存活但在Amp中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达 1000~3000copy④ 安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）不能通过接合转移③ 高拷贝数② 分子小，克隆能力大载体越小越好 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂保留了转移蛋白（mob）的作用位点6 6））pBR322pBR322的缺点的缺点能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！① 删除mob识别位点（如质粒pBR327、pAT153等）。
pAT153：从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数7）PBR322的改进pBR325：在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr） cmlr上也带一个EcoRI位点使EcoRI 也成为插入失活型位点② 改造EcoR I 位点4. pUC4. pUC系列系列University of California的J. Me。