生物电子显微技术生物电子显微技术•电子显微镜的根本知识•电子显微镜的类型及特点• 透射电子显微镜• 扫描电子显微镜• 分析电子显微镜• 双束电子显微镜•电镜生物样品制造技术• 超薄切片制造技术• 负染色技术• 扫描电子显微镜样品制备技术• 冷冻制样技术 第一章第一章 电子显微镜的根本知识电子显微镜的根本知识1－－1.电子子显微微镜的开展概略的开展概略1－－2.电子子显微微镜的根本知的根本知识 1－－1.电子显微镜的开展概略电子显微镜的开展概略一、电子显微镜的发明与开展：一、电子显微镜的发明与开展： 科学科学实际的开展：的开展： 1924年物理学家〔德布年物理学家〔德布罗意〕意〕证明了：明了： 电子与光一子与光一样，具有，具有动摇性；性； 1926年物理学家布施年物理学家布施发表了表了 “关于关于带电粒子在粒子在轴对称称电场、磁、磁场中有聚焦作用〞中有聚焦作用〞裸眼察看物体：器官、裸眼察看物体：器官、组织光学光学显微微镜：器官、：器官、组织、、细胞胞探求更微小的生命方式：病毒探求更微小的生命方式：病毒——超超显微微术人人类的梦想与的梦想与实际的支撑的支撑 导致了致了电子子显微微镜设计思想的思想的产生！生！能能够性性必必然然性性1.电子显微镜发明的必然与可行性：电子显微镜发明的必然与可行性： 2.电子显微镜的诞生：电子显微镜的诞生：Ø电子子显微微镜于于1931年，在德国柏林大学高年，在德国柏林大学高压实验室由室由ØKnoll 和和RUska研制研制胜利，利，证明了由明了由电子束子束为光源、光源、电Ø子透子透镜组成的成的电子光学系子光学系统，可以，可以对物体放大成像。
物体放大成像Ø1932年向世界宣告了年向世界宣告了电子子显微微镜的的诞生Ø1939年年,Ruska在西在西门子公司研制消子公司研制消费了世界上第一了世界上第一Ø 系列商品系列商品电镜，分辨率，分辨率10nm，，40台；台；Ø1935年，年，Knoll首先提出了首先提出了扫描描电镜的的设计思想和工思想和工Ø 作原理；作原理；Ø1942年，年，M.Mullan在在剑桥大学研制大学研制胜利第一台利第一台Ø 扫描描电镜实验室安装；室安装；Ø1965年由年由剑桥大学大学仪器公司第一批商品器公司第一批商品扫描描电镜，，Ø 分辨率分辨率50~100nm，，1万倍初初级构成构成阶段：功能段：功能单一，一，电子管子管时代，操作复代，操作复杂 初期初期3.电子显微镜的开展、走向成熟电子显微镜的开展、走向成熟20世世纪60~80年代，年代，实际以及技以及技术到达成熟的到达成熟的时期成熟成熟阶段：功能多段：功能多样化，晶体管化，晶体管时代，操作复代，操作复杂 4.现代电子显微镜现代电子显微镜高性能、多功能、构造高性能、多功能、构造紧凑、微机化控制凑、微机化控制/ /操作操作 微机化操作系统微机化操作系统 二、我国电镜事业的开展概略二、我国电镜事业的开展概略1.我国我国电镜的研制概略：的研制概略：2.我省我省电镜运用概略：运用概略：三、三、电子子显微运用技微运用技术的概略：的概略：•始于始于20世世纪50年代；年代；•1959年中科院精年中科院精细仪器研器研讨所研制所研制胜利第一台透射利第一台透射电镜XD-100型；型；•1965年中科院科年中科院科仪厂研制厂研制胜利利DX-3型透射型透射电镜，分辨率到达，分辨率到达0.3nm；；•1977年上海新年上海新跃仪表厂研制出表厂研制出DXB-12型透射型透射电镜，分辨率到达，分辨率到达0.2nm;•中科院科中科院科仪厂自厂自KYKY-1000B以后，以后，KYKY-2800型，型，KYKY-3800型型扫描描电镜。
常常规超薄切片技超薄切片技术常常规扫描制描制样技技术冷冷冻复型技复型技术细胞化学技胞化学技术：：酶的的细胞化学，胞化学，免疫免疫电镜技技术负染色技染色技术生物生物纳迷察看与加工技迷察看与加工技术 1－2.电子显微镜的根本知识一、一、电子子显微微镜的的计量量单位：位：1cm 1mm 100μm 10μm 1μm 100nm 10nm 1nm 0.1nm电镜察看〔电镜察看〔nm)光光镜察看察看(μm)裸眼察看裸眼察看(mm)原子和分子原子和分子核酸和核酸和蛋白分子蛋白分子病毒病毒细胞器细胞器细菌细菌细胞细胞动、植物器官、植物器官1μm=10-6m1nm=10Å=10-9m1mm=10-3m1mm=10-3m1μm=10-6m 二、二、电子子显微微镜的照明源的照明源—电子束子束1.电子枪的构造：高压高压偏偏压压0V阳极阳极栅极栅极阴极阴极3V3A阴极：阴极：钨灯灯丝，，产生生电子子栅极：控制极：控制电子束子束阳极：加速阳极：加速电子运子运动2.电子束的产生灯灯丝加加电压，尖端温度升高到，尖端温度升高到2227℃℃时逸出逸出电子，当温度升高子，当温度升高到到2480℃℃时逸出大量逸出大量电子，子，这些些自在自在电子在高子在高压作用下，构成高作用下，构成高能能电子束。
子束 三、电子透镜系统三、电子透镜系统1.实际根据：实际根据：1926年，德国物理学家布施发现：一切带年，德国物理学家布施发现：一切带 电粒子在旋转轴对称磁场或电场中，运动轨迹可以被电粒子在旋转轴对称磁场或电场中，运动轨迹可以被 折射而会聚处理了电子束聚焦的关键问题折射而会聚处理了电子束聚焦的关键问题2.电子透镜的类型电子透子透镜静电电子透镜：静电电子透镜：磁电子磁电子透镜透镜恒磁透镜：用恒磁体激磁的透镜恒磁透镜：用恒磁体激磁的透镜电磁电磁透镜透镜螺线管线圈：磁场非常弱螺线管线圈：磁场非常弱包壳透镜：磁性资料封锁线圈，聚光镜包壳透镜：磁性资料封锁线圈，聚光镜极靴透镜：高导磁性资料极靴，使磁场极靴透镜：高导磁性资料极靴，使磁场 高度集中物镜、投影镜等强透镜高度集中物镜、投影镜等强透镜由静由静电场组成的三成的三级电子子枪 四、电子透镜的相差：四、电子透镜的相差：像差的主要类型像差的主要类型电子光学系统与理想光学系统成像的差别，称为像差电子光学系统与理想光学系统成像的差别，称为像差1.球差：透镜缺陷使近轴磁场与边缘磁场对电子束偏球差：透镜缺陷使近轴磁场与边缘磁场对电子束偏转才干不同，一质转才干不同，一质 点成像为一个弥散球。
点成像为一个弥散球2.像散：由资料性质和加工精度不良引起的磁场分布呈像散：由资料性质和加工精度不良引起的磁场分布呈 非对称性，呵斥在非对称性，呵斥在X,Y方向的放大率不同使图像变形方向的放大率不同使图像变形3.色差：电源动摇引起加速电压动摇，呵斥电子束波长色差：电源动摇引起加速电压动摇，呵斥电子束波长 的变化，使图象分辨率下降的变化，使图象分辨率下降4.畸变：磁场轴上聚焦才干畸变：磁场轴上聚焦才干 弱于轴外聚集才干而使图弱于轴外聚集才干而使图 象变形 五、分辨率：五、分辨率：(分辨力、分辨身手或解像力〕分辨力、分辨身手或解像力〕δ=0.61λ/α0〔〔α0为最正确孔径角，最正确孔径角，λ为电子束波子束波长〕〕指电子显微镜可以清楚分辨出两个质点圆心间指电子显微镜可以清楚分辨出两个质点圆心间最小间隔的才干最小间隔的才干1.概念：概念：2.理想分辨率：理想分辨率：电子子显微微镜分辨率：分辨率：电子束的波子束的波长约：：0.005nm,那么：那么：δ理想理想=0.0025nm •镜筒筒组件加工精度、件加工精度、组装装调试程度、程度、资料性料性质•电镜任任务形状：加速形状：加速电压、合、合轴形状、真空及形状、真空及电源源稳定性定性•样品要素：品要素：样品性品性质、厚度、本身、厚度、本身细节、、导电性性3.影响分辨率的要素：影响分辨率的要素：当加速当加速电压为100时，，λ=0.037Å，，要求要求α0=1.1x10-2rad那么：那么：δ=2.05Å=0.2nm4.实践分辨率践分辨率:δ=0.61λ/α0 前提条件：前提条件：1〕〕仪器在最正确形状；器在最正确形状；2〕〕样品最正确；品最正确；3〕操作最正确。
〕操作最正确 六、放大率〔放大倍数〕六、放大率〔放大倍数〕1.放大倍数：指线性放大，即在显微镜下察看到的物体放大倍数：指线性放大，即在显微镜下察看到的物体 的长度与其实践长度的比值的长度与其实践长度的比值2.有效放大倍数：指裸眼分辨率与有效放大倍数：指裸眼分辨率与显微微镜分辨率的比分辨率的比值即：即：M有效有效=δ人人/δ仪δ人人=0.2mm：：当当δ=0.2nm时，，M有效有效=0.2mm/0.2nm=100万倍万倍当当δ=0.5nm时 M有效有效=0.2mm/0.5nm=40万倍万倍当当δ=5nm时，， M有效有效=0.2mm/5nm=4万倍万倍 !!超出有效放大范超出有效放大范围的放大称的放大称为空放大，或无效放大！空放大，或无效放大！裸眼的分辨率裸眼的分辨率为：：0.2mm光光镜分辨率：分辨率：δ=0.621λ/n·sinα=200nm=0.2µm 七、电子束与样品的相互作用关系七、电子束与样品的相互作用关系二次电子二次电子背散射电子背散射电子弹散弹散X射线射线扫描描电镜扫描透射描透射透射透射电镜吸收吸收弹性散射电子弹性散射电子非弹性散射电子非弹性散射电子透射透射电镜信号主要由透射信号主要由透射电子、部分散射子、部分散射电子构成。
子构成扫描描电镜信号主要由二次信号主要由二次电子构成入射入射电子电子能量分析能量分析 2.透射电子：当样品足够薄〔小于透射电子：当样品足够薄〔小于50nm〕时，部分入射〕时，部分入射电子可以穿透样品而到达荧光屏成像，被叫做透射电子电子可以穿透样品而到达荧光屏成像，被叫做透射电子3.弹性散射电子：入射电子束与样品物质的原子核或弹性散射电子：入射电子束与样品物质的原子核或 电电 子碰撞后，使运动轨迹发生改动，叫做弹性散射电子子碰撞后，使运动轨迹发生改动，叫做弹性散射电子4.非弹性散射电子：入射电子束进入样品后，未发生碰撞，非弹性散射电子：入射电子束进入样品后，未发生碰撞，而是遭到样品物质库仑场的作用，有部分能量损失而使运动而是遭到样品物质库仑场的作用，有部分能量损失而使运动速度变慢，运动方向不变速度变慢，运动方向不变1.入射电子：由电子枪产生的高能电子，又叫一次电子入射电子：由电子枪产生的高能电子，又叫一次电子 电子显微镜中的电子信号电子显微镜中的电子信号 5.二次电子：样品物质原子的核外电子受入射电子激发二次电子：样品物质原子的核外电子受入射电子激发, 获得一定能量而逸出样品外表，就称为二次电子。
获得一定能量而逸出样品外表，就称为二次电子 样品样品10nm表层的二次电子可以逸出样品外表，所以表层的二次电子可以逸出样品外表，所以 它可以反映出样品的外表形状构造它可以反映出样品的外表形状构造6.背散射背散射电子：在子：在样品外表品外表50~1000nm深度，入射深度，入射电子子 与与样品成分品成分发生生弹性碰撞后，被反射会的性碰撞后，被反射会的电子，子， 也叫反射也叫反射电子7.阴极阴极X射射线：：样品原子被入射品原子被入射电子子电离后，可离后，可发出特征出特征X 射射线，， X射射线的的强度与激度与激发区域内相区域内相应的元素的含量有关的元素的含量有关背散射背散射电子子产生的数量与入射生的数量与入射电子的能量、子的能量、样品成分品成分等有关，等有关，这一信号可以察看一信号可以察看样品外表形状和成分差品外表形状和成分差别的的图像 八、八、场深、焦深：深、焦深：D0Df场深与焦深场深与焦深1.场深：指深：指轴上物方的一上物方的一 段段间隔在这一范一范围内内 挪挪动样品到任何位置，品到任何位置， 都能聚焦明晰都能聚焦明晰D0=δ/α0当当电压为100KV，， α0=5x10³时，要求，要求δ=10Å，，D0=2000Å; 假假设 要求要求δ=2Å，那么，那么D0=400Å2.焦深：指透镜像方与场深等效的间隔。
在这一范围内 可恣意挪动像平面，而成像明晰Df=M²δ`/α设 δ‘=5Å，，α=10-3rad:当M=100, Df=5mm当M=1000, Df=500mm当M=10,000, Df=50m 。