1散发性阿尔茨海默病患者 BDNF 基因 G196A 和C270T 单体型及双体型分析作者：钱云，张志珺，张晓斌，袁勇贵，宇辉，施咏梅，柏峰，谢春明【摘要 】 目的：探讨脑源性神经营养因子（ BDNF）基因G196A 和 C270T 单核苷酸多态性（SNPs）在散发性阿尔茨海默病（sAD ）发病机制中的作用方法：采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP ）技术，对 105 例 sAD 患者和 105 例健康对照者 BDNF 基因、载脂蛋白 E(ApoE)基因多态性进行分析结果：(1)sAD 患者 C270T 但非 G196A 基因型及等位基因频率与对照组相比差异有统计学意义(P=0.034 ，P=0.011)2)BDNF G196A 和C270T 单体型分析发现，4 种单体型在 sAD 组和对照组间差异有统计学意义(P=0.048)对照组 H4 单体型频率显著高于 sAD 组，差异有统计学意义(P=0.024)；按 ApoEε4 分层后，在非 ApoEε4 携带者中，该差异仍有统计学意义(P=0.023)对照组基于 H4 的双体型频率显著高于 sAD 组，差异有统计学意义(P=0.029) ；按ApoEε4 分层后，在非 ApoEε4 携带者中，该差异仍有统计学意义(P=0.040)。
结论：BDNF C270T 位点的 SNP 可能与 sAD 的易感性相关，H4 单体型及其构成的双体型是 sAD 的遗传保护因素，对非 ApoEε4 携带者而言尤其如此 2【关键词】 阿尔茨海默病； 脑源性神经营养因子； 载脂蛋白E； 单体型； 双体型阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)病因目前仍未明确，遗传因素是其发病的重要危险因素［1］ 研究表明，载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）ε4 等位基因是散发性AD（sporadic AD，sAD）的危险因素［2］ ，但并非 ε4 等位基因携带者均发展为 AD，提示可能存在其他遗传危险因素尸检发现，AD 患者海马脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF) mRNA 下降［3］ 胎鼠细胞模型研究发现，BDNF 基因 G196A 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）可影响该基因的蛋白表达（缬氨酸替代蛋氨酸） ［4］ ；有研究发现 BDNF 基因 G196A、C270T 与 AD 发病有关［5-6 ］ ，但目前仍存在争议。
本研究对 sAD 患者 BDNF 基因G196A 和 C270T 多态性及其与 ApoE 的相互作用进行分析1 对象与方法1.1 对象3sAD 组患者 105 例，来自东南大学附属中大医院、南京医科大学附属脑科医院和江苏省扬州五台山医院，男 48 例，女 57 例，平均年龄（72.89±6.17）岁痴呆的诊断标准采用美国精神病学会的精神障碍诊断和统计手册第 4 修订版（DSM-Ⅳ）标准首先应用简易智能状态量表(MMSE)、日常生活活动能力量表(ADL)、画钟试验、临床痴呆量表（CDR）初筛有痴呆，然后根据文化程度对可疑痴呆患者进行详细的神经心理学检查，Hachinski 缺血指数分＜4分，Hamilton 抑郁量表排除抑郁症，全部进行头部影像学检查（CT 或 MRI） ，符合美国神经病学、语言障碍及卒中-AD 和相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)很可能 AD 诊断标准，无阳性家族史正常对照组 105 例，男 47 例，女 58 例，平均年龄（72.77±5.79）岁，无痴呆家族史，均为健康体检者受试者均为汉族人，彼此无血缘关系，本人或其监护人知情同意，并获得东南大学附属中大医院伦理委员会的批准。
1.2 方法1.2.1 模板 DNA 提取 取-80 ℃冰箱保存抗凝全血，采用 KI 法提取白细胞基因组 DNA［7］ ，溶于 TE 缓冲液， -20 ℃保存1.2.2 引物合成 引物参照文献［5- 6,8］由上海英俊生物技术有限公司合成41.2.3 PCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳及限制性酶切 PCR 扩增产物 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，参照文献［5- 6,8］对 BDNF G196A、C270T 和 ApoE 基因多态性进行分析，见表 1表 1 BDNF G196A、C270T 和 ApoE 的引物序列、酶切及电泳条件1.3 统计学处理计算各组基因型和等位基因频率，检验其是否符合 Hardy-Weinberg 平衡定律基因多态性位点基因型频率和等位基因频率比较用 χ2 检验采用 SHEsis 软件［9 ］进行连锁不平衡及单体型分析在单体型分析基础上，双体型分析依据两个双体型组执行，采用 SPSS 13.0 统计软件对每个双体型进行 Fisher 精确检验所有统计检验均为双侧检验，P＜0.05 为差异有统计学意义2 结 果2.1 Hardy-Weinberg 平衡法则的吻合度检验sAD 组和对照组年龄（P=0.890）及性别（P=0.890）分布相似，差异无统计学意义。
sAD 组与对照组 3 个 SNPs 基因型观察值与期5望值检测符合 Hardy-Weinberg 平衡定律，表明其基因型频率分布已达到遗传平衡，具有群体代表性（ApoE vs sAD 组χ2=1.052，P=0.789；vs 对照组 χ2=3.017，P=0.389 BDNF G196A vs sAD 组 χ2=0.008，P=0.929；vs 对照组χ2=0.338，P=0.844BDNF C270T vs sAD 组χ2=0.002，P=0.961；vs 对照组 χ2=2.688，P=0.101） 2.2 ApoE 基因型和等位基因频率分布ApoEε4 基因型在 sAD 组中占 41.9%，对照组中占 20.0%，两组差异有统计学意义（P=0.001） 两组 ApoEε4 与非 ApoEε4 的OR=2.885，95%CI 为 1.559～5.340（表 2） 表 2 sAD 组和对照组 ApoE 基因型和等位基因频率分布注：（1)ApoEε4（+）表示 1个或 2 个拷贝的 ε4； ApoEε4（－）表示没有 ε4 拷贝； （2) 括号内为所占百分比2.3 BDNF G196A、C270T 基因型和等位基因频率分布BDNF G196A 和 C270T 酶切图谱见图 1、2 。
BDNF G196A 基因型及等位基因频率在两组间差异无统计学意义（P＞0.05） BDNF C270T 基因型及等位基因频率在两组间差异有统计学意义，sAD 组 T 等位基因频率显著低于对照组（P=0.011 ） ，sAD 组 CT6及 TT 基因型显著低于对照组（P=0.034 ） ， CC 基因型在 sAD 组中占 99.0%，对照组中占 91.4%，两组差异有统计学意义（χ2=6.720，P=0.019，OR=9.750，95%CI 为 1.213～78.397）(表 3) 表 3 sAD 组与对照组 BDNF 基因 G196A 和 C270T 基因型和等位基因频率分布 注：括号内为所占百分比2.4 BDNF 基因 G196A 和 C270T 连锁不平衡及单体型分析G196A 和 C270T 之间存在弱连锁不平衡(弱连锁不平衡：D ＜ 0.5；强连锁不平衡：D ＞0.5；完全连锁不平衡：D =1)（D =0.164 ，r2=0.001 ） 等位基因 G196 与 C270、270T 以及196A 与 C270、270T 配对分别呈单体型 GC、GT 、AC 和ATsAD 组和对照组单体型频率均小于 0.01 时，数据将会被自动删除。
对 G196A 和 C270T 进行单体型分析，4 种单体型在 sAD 组和对照组间差异有统计学意义（χ2=7.890，P=0.048） ，其中 H1和 H2 单体型是常见单体型，sAD 组 H4 单体型频率显著低于对照组（P=0.024）(表 4)表 4 BDNF 基因 G196A 和 C270T 单体型分析注：H1、H2 、H3、H4 依次表示 GC、AC、GT 、AT； 两组间单体型比较， χ2=7.890,df=3,P=0.048； 括号内为所占百分比2.5 BDNF 基因 G196A 和 C270T 双体型分析在 4 种单体型分析基础上进行双体型分析，其中两个位点均是7杂合子构成双体型频率在对照组中显著高于 sAD 组（sAD 组 vs 对照组为 0 vs 5.7%） ，差异有统计学意义（P＜0.05） 按 ApoEε4 等位基因分组发现，非 ApoEε4 等位基因携带者组，两个位点均是杂合子构成双体型频率在对照组中高于 sAD 组（sAD 组 vs 对照组为0 vs 7.1%） ，差异有统计学意义（P＜0.05 ）( 表 5)表 5 BDNF 基因 G196A 和 C270T 双体型分析 注：括号内为所占百分比3 讨 论BDNF 基因位于 11p13-p14，包括 13 个外显子，其编码的蛋白对神经元的存活非常重要［10］ 。
人类 BDNF 主要由海马和大脑皮层的神经元产生，广泛分布于大脑皮层、海马和杏仁复合体，而这些区域在 AD 极早期即出现老年斑（senile plaques，SP）和神经纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs） ［11 ］ 以上研究提示BDNF 基因可能是 AD 的候选基因www.alzgene.org 网站上列出的关于 BDNF 基因与 AD 的 22项研究中，有 8 项发现了阳性结果关于 G196A 的 11 项高加索受试者研究的荟萃分析显示 OR=1.08（95%CI 为 0.98～1.19） ，关于C270T 的 7 项研究荟萃分析显示 OR=1.09（95%CI 为0.70～1.68） 我们的研究表明，BDNFG196A 基因型及等位基因频率在 sAD 组与对照组之间差异无统计学意义，A 等位基因频率在8对照组中为 49.5%，与 Bian、He 和 Tsai 等［12- 14］对中国人群的研究结果类似，均不增加 AD 的发病风险而 T 等位基因可能是独立于 ApoEε2 之外的又一个 sAD 保护因素sAD 与 C270 等位基因正关联，CC 基因型携带者患 AD 的风险比非 CC 基因型携带者明显增高，这与 Desai 等［15］的研究结果相反，可能是由于：(1)该等位基因与真正的致病位点存在连锁不平衡；(2)该等位基因可能是引起疾病的功能位点；(3)由于所选择的研究人群偏倚、人群分层而造成假阳性。
对于复杂多基因疾病，基于连锁不平衡基础之上的关联分析比连锁分析对弱效基因的分析更具有统计效力，特别是在 SNPs 间 LD系数较小时，如 D ＜0.5配对连锁不平衡结果表明，在中国汉族人群中，BDNF G196A- C270T 之间存在弱连锁不平衡考虑到BDNF 基因可能是弱效基因，本研究单体型频率阈值设定为 0.01，从而减少出现假阴性结果的可能单体型分析表明，sAD 与 H4 单体型显著负关联同样，Tsai 等［14］对台湾人群的研究发现，H1单体型是 AD 的保护因素虽然 H4 单体型在对照组中频率较低，但我们认为这个结果仍是有意义的，提示 sAD 发病是多个基因位点协同及交互作用所致两组间双体型分析表明，基于两个多态性位点的杂合子组合的双体型亦是 sAD 的基因保护因素，尤其对非ApoEε4 等位基因携带者来说相对于 ApoE 基因而言，其他位点的致病作用均较微弱此研究结果从分子生物学角度，进一步从基9因水平提供了 BDNF 可能参与 AD 发病机制的实验依据ApoEε4 等位基因是公认的 sAD 的高危因素我们的结果显示，s。