酶活性测定方法 ; 一、过氧化物酶〔POD〕活性的测定POD测定参照李合生等〔2023〕的愈创木酚法办法进行测定，略加改动 测定：称取样品0.5g，参加5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚〔0.2%〕0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液参加到试管中，空白以缓冲液代替在470nm下测定其吸光度，参加酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位△470 ×VTPOD活性=0.01×t×Vs×W式中：△470----反馈时间内吸光度值的变化；VT ----提取酶液的总体积〔ml〕t----反馈的时间〔min〕 Vs ----测定时取用酶液体积〔ml〕 W----样品鲜重〔g〕 二、多酚氧化酶〔PPO〕活性的测定多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的办法，略加改动酶液制备：称取样品0.5g，参加5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。
PPO活性测定：反馈试管中分别参加0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚混匀后于 30℃保温 10 min，迅速参加 2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反馈，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活PPO活性=OD×VT0.01×t×0.5g×Vs =OD×VT 0.005OD——反馈时间内吸光值的变化； VT ----提取酶液的总体积〔ml〕 Vs ----测定时取用酶液体积〔ml〕 T———反馈时间(min)； 三、吲哚乙酸氧化酶〔IAAO〕活性的测定参照张志良等(1990)人的办法并稍作改动规范曲线的制定，配制浓度0~ 250 μg/ml的IAA溶液，分别在530nm下测定吸光度，并绘制规范曲线酶液制备：称取样品0.5g，参加5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心20min后上清液即为粗酶液 IAAO活性测定：量取1ml 酶液+2ml 1mmol/L MnCl2 +1ml 1mmol/L 二氯酚+2ml 1mmol/L IAA+5mL PH=6.0的磷酸缓冲溶液，放入30℃的水浴中30min,对照为2ml 1mol/L的MnCl2+1ml 1mol/L 二氯酚+2ml 1mmol/L IAA+6ml PH=6.0 磷酸缓冲液。
将上述溶液吸取2ml，与4ml反馈液〔0.5mol/L的FeCl31.0ml+35%的过氯酸30ml〕混合置于黑暗处，30℃条件下保留30min，最后测定530nm下的吸光度，并计算酶活性IAAO活性以每mg蛋白质在1h内分解破坏1μgIAA的酶量表示酶活性大小 〔C 1- C 2〕×V T吲哚乙酸氧化酶活性=W×t×V 1[μg/ 〔 g·h 〕 ]式中： C 1 ——对照管在规范曲线上查得 IAA, μg ； C 2 ——测定管在规范曲线上查得 IAA, μg ；V T ——酶液稀释后总体积， mL ；V 1 ——酶液反馈时用体积， mLW ——样品重量， g ；t ——酶促时间， h 四、超氧物歧化酶〔SOD〕活性的测定多酚氧化酶活性测定参照赵世杰等的办法，略加改动酶液制备：称取样品0.5g，参加5ml 0.05mol/L磷酸缓冲液〔PH=7.8〕，冰浴研磨成浆，4℃条件下10000r/min离心10min后上清液即为酶液SOD活性测定：反馈试管中分别参加1.5 mL磷酸缓冲液，0.3 mL130m mol／L的Met溶液，0.3 mL750μmol/LNBT溶液，0.3 mL100μmol/LEDTA-Na2溶液，0.3 mL20μmol/L核黄素，0.25mL蒸馏水，0.05 mL的酶液〔对照加缓冲液，2支〕。
混匀后将1支对照管置于暗处，其他各管于4000lx日光灯下反馈20min〔要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，温度低可适当延长〕反馈结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光光化复原的50﹪为一个酶活性单位表示SOD总活性=[(Ack-AE)×V]／[Ack×1／2×W×a] SOD比活力=SOD总活性／蛋白质浓度SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示； Ack--照光对照管的消光度值；AE—样品管的消光度值； V—样液总体积〔ml〕； a—测定时样品用量〔ml〕 W—样重(g)蛋白质浓度单位为：mg蛋白／g样重五、过氧化氢〔CAT〕活性的测定0.15 mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液反馈液配制：取200mlPBS〔0.15mol，PH=7.0〕，参加0.3092ml 30‰的H2O2〔原液摇匀即可〕酶液制备：称取样品0.2g，参加5ml 0.15mol/L磷酸缓冲液〔PH=7.0〕，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心20min后上清液即为粗酶液样品测定：取3ml反馈液参加0.1ml〔可视情况调整〕酶液，以PBS为对照调零，测定OD240〔紫外〕〔测定40s〕酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位〔μ〕 CAT=[△A240×Vt]／〔0.01×t×W×Vs〕〔μ／g.min〕△A240—反馈时间内吸光度的变化W—样品鲜重〔g〕 t—反馈时间〔min〕Vt—提取酶液总体积〔ml，1.6ml〕 Vs—测定时取用酶液体积〔ml，0.1ml〕 。