分子生物学考试总结47100字 PART Ⅰ 基因（略）PART Ⅱ 原核基因表达体系第五章 细菌转录1、简介：转录产生的RNA链代表了DNA双链的一条链新合成的RNA链为5’-3’，而模板链为3’-5’转录出来的RNA排列与编码链相同RNA合成由RNA聚合酶催化转录起始于RNA聚合酶与DNA上的特定区域的结合——启动子（promoter），这作为转录的开始从启动子开始，RNA聚合酶沿着模板链移动合成RNA，直到到达终止子（terminator）序列这一反应决定了转录单位的形成，即从启动子至终止子的序列均为转录单位，这一区域可能包含不止一个基因 序列优先从起始点（转录RNA的第一个碱基）起始点以上的被称为上游，以下的被称为下游 转录的直接产物被称为初始转录本它包含了从启动子至终止子的5’-3’的全部信息然而，转录起始本通常被直接修饰原核细胞中，它直接被降解（mRNA），或者切割成为成熟的tRNA或者rRNA转录只是基因表达以及调控的第一阶段调控蛋白决定了到底是哪一部分的基因能够被RNA聚合酶转录这一步骤决定了基因的转录与否本章需要谈论的问题主要有两个1、RNA聚合酶究竟是怎样找到DNA上的启动子序列的？推广这一问题为：究竟蛋白质是怎样阅读DNA上的序列来找到特定的结合位点的？ 2、调控蛋白是怎样与RNA聚合酶相互作用来启动或者抑制转录的起始、延长、或者终止过程的？2、转录发生在转录泡中：在通常意义上的转录过程中，RNA一般合成于“转录泡”中，转录泡为解开双螺旋的DNA双链。
RNA链沿着5’-端向3’-端合成游离核苷酸的3’-OH与DNA链上的核苷酸的5’-P相互作用，合成RNA链 RNA聚合酶与启动子结合后就会解离DNA双链形成转录泡当RNA聚合酶沿着DNA模板移动时，其沿着解旋点（unwinding point）解开DNA双螺旋，并且在重旋点（rewinding point）重旋DNA转录泡的长度一般为12-14bp，但是RNA-DNA杂交链区域的长度为8-9bp3、转录反应有三个阶段：转录可以被简单的分为三个阶段，起始阶段：启动子识别、转录泡的形成、以及RNA合成开始延长阶段：转录泡沿着DNA移动终止阶段：RNA转录本释放、转录泡关闭起始阶段开始于模板识别，RNA聚合酶与DNA双链上的启动子结合形成闭合复合体之后，RNA聚合酶使DNA双链解旋形成开放复合体，使模板链能够进行接下来的核糖核苷酸合成转录泡从启动子开始进行局部解旋形成，RNA聚合酶催化这一过程接下来是RNA核苷酸键的合成RNA聚合酶保留在启动子区域同时合成最初的9bp的核苷酸键RNA聚合酶释放最初合成的短的转录本，之后开始重新合成RNA起始阶段的终止于聚合酶成功的延伸最初序列以及启动子序列的确定。
延长阶段：延长阶段中，聚合酶沿着模板DNA链从3’-5’合成5’-3’的RNA链核苷酸加到3’-自由的羟基上终止阶段：聚合酶与终止子结合，此时，不需要额外的碱基加到链中若要终止转录，磷酸二酯键的形成必须终止转录复合体必须分离酶以及RNA分离，DNA序列恢复双螺旋4、酶移动依赖于其晶体结构：1）RNA聚合酶包含一个小沟使得DNA在其中通过，细菌聚合酶的小沟可以容纳16bp，而真核聚合酶能够容纳25bp长度聚合酶表面主要是负电荷覆盖，而小沟里面则为正电荷（主要是激活位点富集的Mg++），因此可以和DNA表面带负电荷的磷酸基团相互作用2）RNA聚合酶主要由以下结构组成：钳子（clamp）、蛋白舵（Rudder）、蛋白墙（Wall）、蛋白桥（Bridge）以及蛋白颌（jaw）3）DNA在蛋白颌的引导下进入小沟，在激活位点附近DNA双链解开，蛋白钳子将上面一条链夹住，蛋白桥通过自身构象的弯曲-直立，使得下面一条DNA模板链的构象改变，使DNA碱基朝外，每配对一个核苷酸，就翻过来一个，以此来来控制核苷酸进入激活位点在蛋白墙的作用下模板链形成DNA-RNA杂交链，RNA在蛋白舵的作用下以单链的形式脱离聚合酶，同时DNA恢复双螺旋。
5、噬菌体T7 RNA聚合酶是一种很重要的模式系统：T3以及T7噬菌体RNA聚合酶有单个亚基，能够以最低限度的活性识别很小数量的噬菌体启动子T7 RNA聚合酶有一种特定的环（β折叠丝带）能够和启动子的-7~-11结合，同时-1~-4进入激活位点6、细菌RNA聚合酶有多个亚基组成：1）E.coli中有一种单独类型的RNA聚合酶表现出了几乎所有的mRNA、rRNA、tRNA合成活性2）RNA聚合酶全酶由四种亚基组成，2个α亚基（每个40kD），功能为酶的组装、启动子的识别、与一些激活因子结合；β、β’亚基（160kD）催化中心，模板链以及编码链都与β、β’亚基作用，位点主要位于转录泡以及下游序列；σ亚基（32-90kD）与启动子的识别有关7、启动子识别依赖于一致性的序列：细菌启动子主要由四种保守元件（或者五种）组成1）起始点（startpoint）：通常>90%情况下为一个嘌呤（起始位点为5-9bp长）2）-10区序列：起始点上游有6bp的序列在几乎所有的启动子中都能够找到，这六个序列中间一个到起始点相隔10bp，因此称为-10区，其六个一致性序列为TATAAT3）-35区序列，六序列：TTGACA。
4）-35区与-10区之间为分隔区，占到了启动子序列的90%，从15bp到20bp不等这段距离对于RNA聚合酶的几何学距离有很大作用5）有一些启动子在上游远一些的距离还有一段A-T富集序列这被称为UP元件它与RNA聚合酶的α亚基作用，在编码rRNA的基因中较多8、突变能引起启动子效率的上调或者下降：1）-35区的突变通常影响RNA聚合酶与DNA的最初识别因此我们可以将-35区视为识别结合域2）-10区域的突变通常影响DNA的解链，会将开放复合体闭合因此我们可以将-10区视为解链区因为-10区A-T富集，使其打开需要的能量较少3）RNA聚合酶结合过程：首先与-35区的RNA聚合酶最初接触，其次闭合包围启动子区域，最后在-10区解链DNA形成开放复合体9、替换σ因子可能控制转录起始：1）E.coli有很多σ因子，每一种都会使得RNA聚合酶与不同的启动子结合2）σE70被用于一般性的转录调控其他的σ因子只在特殊条件下被激活3）σ用于逆境胁迫、σ54S32用于热击作用、σ同样用于热击作用、σ用于氮素缺乏、σ28用于鞭毛合成4）σ因子调控启动子的识别：σ70全酶识别一种启动子，当替换σ因子之后则导致聚合酶识别另一种启动子。
10、σ因子直接与DNA互作：1）E.coli 的σ70因子由一些保守序列组成，2.1，2.2区与核心酶互作，2.3作用于DNA解链，2.4,4.2与-10区、-35区的启动子元件相作用1.1,1.2区的N-端序列阻止没有核心酶的情况下2.4,4.2区与DNA的结合其中，2.4区组成α-螺旋与-10区编码链的特定碱基作用Thr、Gln→T，Trp、Tyr→A2）σ因子的N端序列与DNA结合域结合其与DNA的结合当开放复合体形成之后，N-端序列绕过20A的距离，与DNA结合域分离10、σ因子可能有组织的进行级联反应：1）在噬菌体SPO1感染枯草芽孢杆菌的过程里面，涉及到基因表达的三个阶段，早期基因、中期基因、晚期基因，他们之间的换转是通过σ因子来调控的2）早期基因表达时，σ43引导细菌全酶识别噬菌体的启动子之后，基因28表达新的σ因子替换细菌σ43因子中期时，gp28-核心酶转录噬菌体中期基因，中期基因33和34编码新的σ因子替换gp28σ因子晚期时，gp33-gp34核心酶转录噬菌体晚期基因但是这其中的机理目前还不得而知11、转录的终止——细菌RNA聚合酶在分离的位点终止：1）对于终止子我们并没有一个准确的定义，转录通常表现为3’-末端的初始转录本被切割，之后并不特别表现为在某一位点RNA转录停止。
因此，我们只是找到了两类转录终止子的特征1、细菌以及噬菌体中终止子的序列与最后加到RNA上的序列不同，终止依赖于模板或者产物的校正机制2、许多终止子需要一种发夹结构来停止RNA转录这意味着转录终止并不仅仅依赖于DNA序列的校正机制，还依赖于RNA产物自身的结构2）一些终止子的终止作用会被抗终止而导致酶继续转录终止子之后的序列这一过程被称为通读12、E.coli中两种类型的终止子： 1）第一类为内在终止子（intrinsic terminator），这类终止子可以在核心酶缺乏其他因子的情况下终止转录；第二类为Rho-依赖型的终止子，这类终止子需要外源的Rho（ρ）因子来协助终止2）内在终止子的终止机制：内在终止子有7-20bp的回文序列区来帮助形成发夹结构，发夹结构环中主要为G-C富集区，发夹结构之后为一系列的U残基这两段通常距离很短，一般大约为7-9bp点突变的研究结果表明，发夹结构减慢了RNA聚合酶的合成速度，之后下游的U-富集区域使DNA-RNA杂交链不稳定化，通常情况下，rU-dA键碱基配对结构不稳定，容易解链，因此我们可以看到RNA上U-富集区域与DNA链上A-T对相对应，这说明A-T对在转录起始以及终止过程均起到重要作用。
3）入噬菌体的终止因子：Nus因子在转录终止中起作用内在转录终止子需要NusA，NusB-S10蛋白参与Rho-依赖型的转录终止NusB-S10蛋白与nus的boxA序列结合，NusA与nus的boxB序列结合NusA增加了RNA聚合酶在转录终止子附近暂停的趋势（其对其他二级结构也起到同样的作用）NusB以及S10组成的二聚体与包含boxA的RNA结合NusG可能起到降所有的Nus因子组装成复合体从而与RNA聚合酶结合的作用4）内在终止子与Rho-依赖型的终止子需要不同的Nus因子，内在终止子需要NusA因子，这个终止作用被pN蛋白阻断Rho-依赖型的终止需要所有四种Nus因子，同样pN可以阻断这种终止作用通常认为pN蛋白与NusA因子结合从而起到抗终止的作用13、Rho因子究竟是怎样起作用的？1）Rho依赖型的终止子占到大肠杆菌终止子的一半左右，Rho因子需要与车辙序列（rut sequence）结合来发挥作用车辙序列为一段C富集G缺乏序列，位于转录终止子上游2）Rho因子分为两部分，N-端RNA结合结构域以及C-端ATP酶结构域组成一个六聚体结构，其5’-端与RNA结合形成二级结构，RNA绕其一圈，从5’-端出去。
3）作用过程：1、RNA聚合酶转录DNA2、Rho与RNA上的车辙序列结合3、Rho沿RNA运动4、RNA聚合酶在发夹结构处停止，之后Rho因子追上5、Rho因子解旋DNA-RNA杂交链6、终止作用：所有的组分释放4）Rho因子可能将转录以及翻译产生联系，在野生型中，核糖体与mRNA结合会抑制Rho因子的结合或者运动，当翻译完成之后，核糖体脱落，Rho因子追上RNA聚合酶，转录终止，所有组分脱落14、抗终止作用是一种调控：1）抗终止是一种转录控制机制，其阻止转录终止于终止子，使RNA聚合酶越过终止子继续转录2）通读：转录以及翻译中的通读现象发生于RNA聚合酶或者核糖体由于模板或者是辅助因子作用而忽视终止信号的现象3）抗终止蛋白允许RNA聚合酶转录终止子之后的序列4）最佳的研究例子为入噬菌体宿主RNA聚合酶转录入基因并且在t位点终止N基因控制噬菌体早早期基因以及晚早期基因的转录，pN允许其通读到终止子之后的L以及R1单位，这样晚早期基因就会转录Q基因控制噬菌体晚期基因的表达，pQ允许其通读到R’终止子pN作用于nut位点，pQ作用于qut位点，这些位点都位于转录单位的不同位置nutL位于起始位点附近，nutR位于终止子之前。
Qut位于启动子之间。