鸡胚成纤维细胞的制备一、材料和试剂 1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚 2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠 3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等二、操作步骤1、操作前的准备：预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染点燃酒精灯：注意火焰不能太小准备好将要使用的消毒后的培养瓶取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内2、成纤维细胞制备：①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘② 无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。
③再用PH7.2的PBS冲洗两次④用镊子捏成小块（2-3mm3）, 用PH7.2的PBS冲洗两次⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次⑥期间配制细胞培养液：培 养 基：MEM双 抗：2%7.5% 碳酸氢钠：2%牛 血 清：6%3% 谷氨酰胺：1%⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次⑧加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）⑨将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤⑩重复步骤⑨的操作重虑一遍 计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个分装置个培养瓶中（7-8ml/瓶），置37℃培养箱培养样品的接种一、材料和试剂 1、细胞：贴壁细胞株 2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠 3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶，1.5mlEP管，酒精棉球，废液缸等 二、操作步骤1、接种前准备：预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染点燃酒精灯：注意火焰不能太小准备好将要使用的消毒后的培养瓶取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒 ２、接种：待成纤维细胞长成单层后（一般是在制备后２４小时），无菌取出要用的五个方瓶，设置成三组实验组两个，空白对照组一个，阳性对照组两个；倒掉原有的细胞培养液，用ＰＨ７.２的无菌ＰＢＳ洗一遍，再按照如下表格分组，加样分组空白对照组实验组阴性对照１１２１２加样０.４ml培养液０.４ml样品０.４ml样品０.４ml病毒液０.４ml病毒液条件3７℃孵育30min，期间15min轻摇一次②待孵育完成后倒掉接种液，加细胞生长液８ml／瓶，放入3７℃培养箱培养，次日更换维持液。