植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、 放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等由于酶联免疫 吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays,简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方 便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式（见下图），一种是在固相载体上直接包被抗体（直接法， 先包被二抗，再加一抗），另一种是包被抗原（间接法）直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离 抗体进行竞争间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素一蛋白质复合物根据质量作用 定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成 的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H 量的多少。
材料、试剂及设备1材料各种新鲜植物材料2仪器设备研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸， 恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10p l，40p l,200p l,1000p l）， 带盖瓷盘（内铺湿纱布）3试剂（1） 包被缓冲液：称取1. 5 g Na2CO3, 2.93g NaHCO3 0.2g NaN3 （可不加），用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为9.6.（2） 磷酸盐缓冲液（PBS）:称取 8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 - 12H2O，用量筒加1 000 ml 蒸馏水，pH 为 7.53） 样品稀释液：100 ml PBS中加0.1 ml Tween-20，0.1g明胶（稍加热溶解）4） 底物缓冲液：称取5.10gCHO ・HO（柠檬酸），18.43g Na HPO・12HO,溶解定容至1 000ml，6 8 7 2 2 4 2再加 1 ml Tween-20， pH 为 5.05） 洗涤液：1000ml PBS 加 1mlTween-206） 终止液：2mol/L H2SO4。
7） 提取液：80%甲醇，内含1 mmol/L BHT（二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解 BHT，在配成80%的浓度））8） 激素包被抗原、各激素抗体和标准物9） 酶标二抗：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔抗体操作步骤1. 样品中激素的提取（1） 称取0.5-1.0g新鲜植物材料（若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻后保存在-20°C的低 温冰箱中），加2ml样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10ml试管，再用2ml提取液分次将研 钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4C冰箱中2） 4C下提取4h，1 000g离心15min（实验中离心机型号LDZ5-2，约4 000rpm）,取上清液 沉淀中加1ml提取液，搅匀，置4C下再提取小，离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去3） 上清液过C-18固相萃取柱具体步骤是：80%甲醇（1ml）平衡柱一上样一收集样品一移开 样品后用100%甲醇（5ml）洗柱一 100%乙醚（5ml）洗柱一 100%甲醇（5ml）洗柱一循环4） 将过柱后的样品转入5ml塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇， 用样品稀释液定容（一般1g鲜重用1.5ml左右样品稀释液定容）。
2. 样品测定（1） 包被：在10ml包被缓冲液中加入一定量的包被抗原（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀， 在酶标板每小孔中加100M l然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，置于37C下3h2） 洗板：将包被好的板取出，放在室温下平衡然后甩掉包被液，将下口瓶内的洗涤液通过乳 胶管均匀加入板上，使每孔充满洗涤液，放置约0.5min，再甩掉洗涤液重复3次，将板内残留洗 涤液在吸水纸上甩干3） 竞争：即加标准物、待测样和抗体加标样及待测样：取样品稀释液0.98ml，内加20p l激素的标样试剂（100p g/ml），即为 2000ng/ml 标准液，然后再依次稀释 1000ng/ml, 500ng/ml,250/ng/ml,125ng/ml・・・，0ng/ml将系列 标准样加入96孔酶标板的前三行，每个浓度加3孑L，每孔50p l,其余孔加待测样，每个样品重复 三孔，每孔50p l加抗体：在5ml样品稀释液中加入一定量的抗体（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀后每孔加 50p l，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争竞争条件37C左右0.5hGA4为37C、17分钟）（4） 洗板：方法同包被之后的洗板。
但要注意以下两点：①加洗涤液时一定要从标准曲线的低浓 度一边向高浓度一边加，并且酶标板要向高浓度的一边倾斜②第一次加入洗涤液后要立即甩掉 然后再接着加第二次注意这两点的目的是防止各孔的交叉反应5） 加二抗：将一定量的酶标羊抗兔抗体，加入10ml样品稀释液中（最适稀释倍数见试剂盒标 签），混匀后，在酶标板每孔加100p l，然后将其放入湿盒内，置37C下，温育0.5h6） 洗板：方法同竞争之后的洗板（步骤4），洗五次，（7） 加底物显色：称取10-20mg邻苯二胺（OPD）溶于10ml底物缓冲液中（小心勿用手接触OPD）， 完全溶解后加2~4p l 30% H202混匀，在每孔中加100p l （在暗处操作），然后放入湿盒内，当显 色适当后（即0ng/ml孔与2000ng/ml孔的OD差值为1.0左右时），每孔加入50p l 2mol/L硫酸终 止反应8） 比色：用2000ng/ml浓度孔（即标准曲线最高浓度孔）调0，在酶联免疫分光光度计上依次 测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值结果计算与分析用于ELISA结果计算最方便的是logit曲线曲线的横坐标用激素标样各浓度（ng/ml）的自 然对数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。
Logit值的计算方法如下：B/B0 BLogit（B/Bln —— =ln 0 1-B/B0 B0-B其中Bo是0ng/ml孔的显色值，B是其它浓度的显色值作出的logit曲线在检测范围内应是直线待测样品可根据其显色值的logit值从图上查出其 所含激素浓度（ng/ml）的自然对数，再经过反对数即可知其激素的浓度（ng/ml）另外，也可用激素标样各浓度（ng/ml）的自然对数与各浓度显色值的logit值的回归方程代替 logit曲线，求得样品激素的浓度一般来说，二种方法求得的结果会略有差异求得样品中激素的浓度后，样品中激素的含量（ng/g-fw）可用下式计算：N-V2-V3-BA = —-— V -W1其中，A表示激素的含量（ng/gfw）；V2表示提取样品后，上清液的总体积；V1表示进行真空浓缩干燥的上清液体积；（当提取的上清液全部进行真空浓缩干燥时V1与V2的体积是相等的）V3表示真空浓缩后用样品稀释液定容的体积；W表示样品的鲜重；N表示样品中激素的浓度（ng/ml）；B表示样品的稀释倍数（样品稀释液定容以后的稀释倍数）注意事项激素提取液中是否存在干扰物质的判断和去除通常用以下几个质量控制试验来判断提取液中是否存在干扰物质：①稀释试验，即将样品提取 液做一系列稀释，进行ELISA测定，所获得的剂量反应曲线应与标准曲线平行，或者说测定值与稀 释倍数相对应，例如做10倍稀释，则测定值应是原值的1/10，若差异太大，表明有干扰物存在。
②平行试验，即将样品提取液定量加入系列浓度的标准物之中，进行ELISA测定，所得出的标准曲 线应与不加样品液的标准曲线平行，否则可以断定有干扰物存在③回收率试验，将样品分为完全 等量的两份，一份加入已知量的标准激素，另一份做对照，进行提取测定，两个测定值之差与加入 值之比即为回收率，若回收率过低或者超过100%，也说明有干扰物存在④仪器法校正试验，ELISA 测定的样品量极微，而且样品纯度要求比仪器法要低得多，因而用通常的气谱或液谱法难以对ELISA 作出校正，目前用高分辨率的气质联机可以对ELISA作出校正，目前用高分辨率的气质联机可以对 ELISA测定作出适当的评价样品中存在的干扰物质有色素、酚类物质等酚类物质可用可溶性与不可溶性PVP （聚乙烯毗 咯烷酮）除去，可溶性PVP可直接溶于样品提取液中，不溶性PVP可在研磨时加入一般材料在加 入0-100mgPVP/gFW即可达理想效果叶绿素等色素可通过将激素提取液过C18预处理小柱去除2为得到较好效果，操作一定要认真，注意：（1）在整个ELISA操作过程中，每次加样尽可能 一致，速度要快2）若同时做二块以上的板，应将洗好的板放在4°C下，依次拿出加样。
3）加 样的环境温度不宜过高4）不使用边缘孔时，每次加样后，也应在边缘孔内加入相应的溶液5） 在正式样品测定之前，先通过预备试验找到包被抗原、抗体、二抗的最适稀释倍数及标准物的最佳 范围6）抗原、抗体、二抗及标准物保存在一20C下，随用随拿，并尽量缩短取样时间3关于影响ELISA测定结果的两个问题：①线性检测范围，是指logit标准曲线中的线性测定 范围在样品测定过程中，应选择合适的稀释倍数，使测定结果落在logit标准曲线的线性范围之 内②交叉反应，是指抗体与被测定激素以外的物质所起的反应在样品测定过程中，要注意与抗 体有较高交叉反应的物质，并尽量将其在提取液中排除。