实验七 微生物显微计数-－血球计数板法一、目的要求1．了解血球计数板的构造和使用方法 2．学会用血球计数板对酵母细胞进行计数二、基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法此法的优点是直 观、快速将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的 计数室中，在显微镜下进行计数由于计数室的容积是一定的（0. Imm2）,所以可以根据 在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目由于此法计得的是活 菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台中间的平台又被 一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间 的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16 个中方格，而每个中方格又分成 25 个小方格；另一种是一个大方格分成25 个中方格，而每个中方格又分成1 6 个小方格 但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16X25=400小方 格0.100mm1 2 mm400每一个大方格边长为1mm,则每一大方格的面积为1mm2,盖上盖玻片后，载玻片与盖 玻片之间的高度为0. 1mm,所以计数室的容积为0. 1mm3。
在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或 25,就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算:设五个中方格中总菌数为A, 菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数因 lml=lcm3=1000mm3,CflPO.lmm3中的总菌数）为y X 25XB：o故1皿1菌液中的总菌数=£ X 25X 1OX 1OOOX B=50000A ・B （个）同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A\则1逊菌被中总菌数二令X 16X 10X 1OOOXB，!= ：-32'OtlOAl * B1 （邂＞三、器材 酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管四、操作步骤1．稀释 将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释2．镜检计数室 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检若有污物，则需清洗后才能进行计数3．加样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖 玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数 室均能充满菌液。
注意不可有气泡产生4．显微镜计数 静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置， 然后换成高倍镜进行计数在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数 一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜每个计数室选5个中格（可选4个角 和中央的中格）中的菌体进行计数位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的如遇酵 母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数计数一个样品要从两个计数室 中计得的值来计算样品的含菌量5．清洗血球计数板 使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干 或用吹风机吹干镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物若不干净，则必须重 复洗涤至干净为止五、实验报告1 ．结果将结果记录于下表中A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数1、如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样 很容易生长总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始2、 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
3、 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活4、 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成 细胞无法存活5、 何谓 FBS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum)是指胎牛血清,CS (calf serum)则是指小牛血清HS (horseserum)则是 指马血清6、 培养细胞时应使用5 %或10% CO2?或根本没有影响？一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统，而培养基中 NaHCO3 的含量将决 定细胞培养时应使用的CO2浓度当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5 % CO2培养细胞7、 Hank's平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。
原因是什么？ Hank's平衡盐溶 液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L)中高碳 酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值Eagles液在空气水平的CO2中，溶液会变碱， Hanks液在CO2培养箱中会变酸如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，如果仅仅 是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了8、 细胞之接种密度为何？ 依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因9、 悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养 角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入 新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可10、 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并 注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。
另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂11、 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对 DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)， 在解冻之后， 应 直接放入含有 10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可， 如此 可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题12、 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na第一次开瓶后应立即少量分装 于无菌试管中，保存于20 9,避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会13、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm), 5 - 10分钟，过高之转速，将造成细 胞死亡14、 细胞冷冻培养基之成份为何？ 动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。
注意：由于DMSO稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成15、 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身 即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于49,避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO之Nylon材质滤 膜16、 冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一：冷冻管置于4 °C 30~60分钟—(-20 °C30分钟*) — -80 °C 16~18小时(或隔夜) f液氮槽vaporphase长期储存冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C至-80 °C以下，再放 入液氮槽 vapor phase 长期储存 *-20 °C 不可超过 1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可 跳过此步骤直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些17、 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？ 冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。
18、 培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素19、 应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌主要的污染原因为无菌操作技术不当、 操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来 源和培养基配制是减低污染之最好方法20、 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？ 原则上：直接灭菌后丢弃之当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或 酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素 产生毒性的剂量水平这点在使用抗生素如两性霉素 B 和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要下面是推荐的 确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤1) 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度2) 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加 入到每一个孔中例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25, 0.50，1.0，2.0, 4.0,8.0 mg/ml。
3) 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆4) 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2〜3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2〜3代5) 在无抗生素的培养基中培养细胞一代 6)重复步骤 47)在无抗生素的培养基中培养4〜6代，确定污染是否以已被消除21、 支原体(mycoplasma)污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？ 不能除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之22、 支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据故进行实验前，必须确认细 胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义23、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？ 直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株24、CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？ 定期（至少每两周一次） 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之25、 为何培养基保存于4 °C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？ 培养基保存于 4 °C 冰箱中， 培养基内之。