花青素对人胃腺癌细胞凋亡的诱导增殖的抑制作用Ping-Hsiao Shih, Chi-Tai Yeh, Gow-Chin Yen食品科学系，国立中兴大学摘要花青素是富含水果和蔬菜的天然红色色素探讨花色苷的抗肿瘤机理的基础上，五元（矢车菊素、飞燕草色素、锦葵色素、天竺葵素和芍药）和四（cyaniding-3-glucoside糖化，malvidin-3-glucoside，pelargonidin-3-glucoside花色苷和芍药素-3-葡萄）被用来研究其影响细胞周期进程和在人胃腺癌AGS细胞凋亡的诱导作用从细胞活性实验数据表明锦葵色素表现出最有力的抗增殖效应对AGS细胞呈时间和剂量依赖性（P＜0.05）此事件是伴随着逮捕AGS细胞于G0/G1的锦葵色素在测试浓度的0–200 LM相花色素苷和花色素细胞吸收的高效液相色谱分析和二甲花翠素在细胞内的积累证实（24.9±1.1流明／mg蛋白）时观察到处理AGS细胞12 h后，此外锦葵色素，在AGS细胞G1期的积累（20%和30%增加100和200流明的锦葵色素，分别）观察以及与aneudiploid DNA含量的细胞的一小部分的外观诱导细胞凋亡的发生是锦葵证实了形态学和生化功能，包括凋亡小体的形成，caspase-3的活化和聚（ADP核糖）聚合酶蛋白水解。
此外，凋亡细胞的线粒体膜电位治疗后明显失去了锦葵导致Bax/Bcl-2比值升高1.6对控制100 LM治疗此外，二甲花翠素治疗显着增加p38激酶的表达和抑制ERK的活性，并对caspase-3的激活二甲花翠素e ects受阻，分别通过ERK和p38抑制剂这些研究结果表明生长抑制和AGS细胞毒性作用的锦葵涉及在诱导细胞凋亡，而不是坏死1、介绍随着饮食习惯和食物的过度过程的变化，胃肠道疾病的趋势是上升的胃癌是一种胃肠道（GI）道癌是癌症相关的死亡率在世界上约90%的胃癌的主要原因是腺癌—例（2003 Kelley Duggan）研究表明，大量摄入烟熏、腌制、硝化食品和碳水化合物，但低摄入蔬菜、水果、和牛奶，都与癌症的发病率这些饮食已被证明显着增加胃癌的风险（塞拉菲尼等人，2002）流行病学的研究提供了令人信服的证据表明，饮食因素可以修改癌变过程，包括启动、促进和几种类型的人类癌症的发展（瑞，2005）在过去的十年中，胃肠道（GI）癌症的发生显著增加例（2003 Kelley Duggan）研究表明，大量摄入烟熏、腌制、硝化食品和碳水化合物，但低摄入蔬菜、水果、和牛奶，都与癌症的发病率这些饮食已被证明显着增加胃癌的风险（塞拉菲尼等人，2002）。
流行病学的研究提供了令人信服的证据表明，饮食因素可以修改癌变过程，包括启动、促进和几种类型的人类癌症的发展（瑞，2005）在过去的十年中，胃肠道（GI）癌症的发生显著增加尽管早期的进步检查、诊断和治疗的化学药物和复发的侧效应仍然存在的问题因此，胃癌化疗/车mopreventive剂的发展减少这种疾病造成的死亡率是非常重要的花青素是花青素苷与大学莎莉吸引力，丰富多彩，美味的水果最近，有兴趣的花青素由于其潜在的生物学和药理学的好处，如中兴：抗氧化剂（莫耶et al.，2002），抗炎（subarnas和瓦格纳，2000），减少心血管疾病的风险（2002王和马扎，），和抗肿瘤的特性（katsube等人，2003）动物研究显示，进食与花色苷提取物的保护对叔丁基过氧化氢诱导的肝毒性（王et al.，2000）和降低脂质过氧化、DNA损伤大鼠维生素e-depleted（Ramirez Tortosa等，2001）最近，花青素被证明是一种有效的化学预防剂对1,2-dimethyhydrazine和2-amino-1-methyl-6-phenylimi-dazo [4,5-b]吡啶诱导的乳腺癌的大鼠（Hagiwara et al.，2002）。
此外，花青素可以直接吸收并分布到血液（Tsuda et al.，1999），并被纳入细胞培养，在细胞膜和细胞质（Youdim et al.，2000）大量的研究表明，花青素具有很强的清除自由基的抗氧化活性（王等，1997），这表明他们在防止突变和汽车发生中起着重要的作用（Omenn，1995）花青素还具有抑制效应，对某些癌细胞的生长（龟井静香et al.，1995）我们最近的研究报告（Yeh和日元，2005），诱导细胞凋亡的花青素通过Bcl-2基因和c-Jun氨基末端激酶级联在肝癌细胞中激活的调控然而，关于保护E等对胃腺癌花青素是有限的研究；因此，本研究的目的是确定是否花青素会在胃癌发生的预防有用车在目前的研究中，培养的人胃腺癌细胞（AGS）选择研究AGS细胞已被证明在裸鼠体内生长有取自患者标本的组织化学和细胞学特征它是描述详细的方式体外培养的人肿瘤细胞的重要，因为他们作为其他研究涉及异构反应抗癌药物的良好模型系统（Barranco et al.，1983），最近该细胞系已广泛用于评价肿瘤细胞凋亡模型系统（刘等铝，2003）细胞凋亡是细胞死亡的定义式，有别于传统的细胞死亡，坏死最近的许多研究表明，抗癌药物或癌症的车mopreventive代理通过诱导细胞凋亡，以防止肿瘤的促进，进展，并发生细胞炎症反应以外坏死。
细胞凋亡是基因定向的细胞死亡形式与特征的形态学和生化特征（布朗、Attardi，2005）细胞凋亡的启动似乎是许多细胞毒性化疗药物使用一个共同的机制因此，凋亡诱导剂有望成为理想的抗癌药物此外，一些黄酮类，如槲皮素、芹菜素、根皮素，通过诱导细胞凋亡，抑制癌细胞生长（王等，1999）因此，了解细胞凋亡的机制已经在很多疾病的预防和治疗的重要意义在这项研究中，我们研究了五种典型的凋亡诱导花青素和胃腺癌细胞相对显著外界此外，还确定了凋亡效应引起的二甲花翠素的分子机制材料与方法2.1材料[氯化花青素色素、飞燕草酰氯，二甲花翠素氯，氯化天竺葵色素、芍药苷氯化]，[ cyanidin-3-o-gluco-side氯化，氯化锦葵花素葡萄糖苷（葡萄霜），天竺葵-3-O-葡萄糖苷、氯化及氯化peonidine-3-o-glucoside ]获得extrasynthese（Genay，法国）人肺腺癌AGS细胞购自保存及研究中心（BCRC，食品工业发展研究所，Hsin Chu，台湾）山羊抗兔IgG多克隆抗体结合过氧化物酶获得西格玛化学有限公司（圣路易斯，穆村，美国，美国）抗ERK磷酸化ERK、JNK反，反，反JNK的磷酸化，anti-p38，anti-phospho-p38，anti-capsase-3，抗多聚（ADP-核糖）聚合酶，并anti-b-actin抗体从细胞信号技术获得（贝弗利，MA）。
抗Bcl-2，Bax抗体和抗得到pharmingen（圣地亚哥，CA）从Pharmacia Biotech获得蛋白质分子质量标记（萨克莱，法国）polyvinyldi氟（PVDF）得到的微孔是蛋白印迹膜（Bedford，MA，美国）细胞培养AGS细胞在火腿的f-12k培养基10%热灭活胎牛血清（FBS）进行培养和抗生素（100 U/ml青霉素，100 LG电子/毫升链霉素）37 LC在湿润的大气中5%的CO2在实验过程中血清浓度调整为5%P. H. Shih等人食物及化学毒理学43（2005）1557 - 1566，15592.3细胞形态学观察形态控制细胞和样品相差显微镜检测细胞（尼康）细胞活性检测细胞活力检测MTT光度量分析和台盼蓝拒染法进行在MTT比色法，5•104细胞接种于96孔培养板细胞无或VA不同样品浓度的不同培养结束时，上清液进行交换90将新鲜培养基和MTT将10（1毫克/毫升）溶液37 LC孵育3小时后，吸气中溶解的紫罗兰水晶100将DMSO和MTT还原程度的ELISA测定器花青素和花青素的细胞毒性是通过培养2•105细胞在24孔培养板与未处理样品的不同实现收获细胞，台盼蓝将增加10（0.4%）。
染色排斥法进行计算的死亡细胞的数量超过控制细胞采集和高效液相色谱法测定细胞内花青素和花青素含量孵育后的花色苷和素anidin（500流明）与AGS细胞4、8、12和16 h后，细胞用PBS洗两次，然后细胞内花青素和花青素的测定方法是开达等人1996）和Youdim等2000）细胞颗粒悬浮在1%的Triton X-100和1 N HCl会10会10，涡旋大力和允许站在4 LC 20分钟的高效液相色谱分析（配备二极管阵列检测器命中达到l-7455日立l-6200智能泵）与LiChroCART RP-18反相柱（200•4毫米，5流明）和使用由水/甲酸流动相（90:10，v/v）（溶剂）和水/乙腈/甲醇/甲酸（40:22.5：22.5:10，v/v）（溶剂B）初始条件为：20%、0和15分B之间从20%增加到25%，15–60分B从25%增加到40%，60–80分B从40%增加到80%，在80分钟的流动相被切换到原来的启动条件（20% B），在此举行条件下注射前10分钟流式细胞仪分析探讨影响二甲花翠素对AGS细胞的细胞周期分布，细胞（2•106细胞/毫升）与不同浓度的二甲花翠素培养0–处理72 h后，用磷酸盐缓冲洗—提供的75%乙醇在4 LC在晚上与固定的盐水。
用冷PBS洗涤2次后，细胞悬浮于PBS中含有40的LG／ml碘化丙啶（PI）和0.1 mg/ml RNase跟着震动37 LC 15分钟细胞进行流式细胞仪分析（Becton狄金森immunocytometery系统，圣若泽，CA）和数据结果进行细胞的探索与模型拟合线粒体膜电位（DWM）线粒体膜电位与J-聚集体形成亲脂性化合物5，50，6，6，1，3 tetrachloro-1，分析，3 tetraethylbenzamidazolo carbocyanin碘（JC-1），已被纳入mitopttm试剂盒（Serotec公司有限公司，英国），是线粒体通透性转换性好的检测（PT）在细胞凋亡事件1•AGS细胞105细胞/毫升）接种到96孔板和治疗表明时间的二甲花翠素不同浓度后孵育细胞染色与mitopttm染料试剂37 LC 15分钟在CO2培养箱通过荧光分光光度法检测骨料的红色星系形式（BMG实验室技术有限公司O森堡，德国）在485 nm的激发和发射波长在520后与对照相比，凋亡细胞呈绿色荧光积累Caspase-3活性的测定为半胱天冬酶活性测定，酶caspase-3下游执行评价细胞与不同剂量分别为ERK和p38抑制剂预处理，1 h后，和二甲花翠素治疗（100流明）最后48小时的Caspase-3活性测定，通过蛋白水解裂解的荧光底物利用caspatagtm（DEVD）Caspase-3活性试剂盒（生物科技有限公司，美国）。
1•细胞106细胞/毫升）从不同的治疗方法进行收集和培养工作稀释试剂37 LC 1 h，用洗布儿洗涤后，将细胞重新悬浮，PBS和荧光强度与激发波长485 nm和520 nm处的发射波长荧光分光光度计检测Western blot从AGS细胞的胞浆蛋白（2•106细胞/毫升）与100流明锦葵不同时间处理后总蛋白加入800将冷溶解卜二提取（50毫米的Tris–HCl，pH值为7.4；1毫米氟化钠；氯化钠150毫米；1毫米1毫米phenylmethylesulfonyl EGTA；氟化物；1%充电；10 LG电子/毫升亮肽素）对冰的细胞颗粒30分钟，离心其次为12000转为10分钟，在4分钟Bio-Rad直流试剂盒与牛血清白蛋白测定上清液中蛋白质浓度（BSA）为标准细胞裂解液混合4•样品布儿（8% SDS；考马斯亮蓝R-250甘油0.04%；40%；200。