实验九 水中总大肠菌群的测定－多管发酵法一、实验目的和要求1、掌握多管发酵法测定水中总大肠菌群的技术2、预习第二章有关活性污泥的有关内容二、原理总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能 发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤 进行检验求得水样中的总大肠菌群数试验结果以最可能数（most probable number）,简 称 MPN 表示三、仪器1. 高压蒸气灭菌器2. 恒温培养箱、冰箱3. 生物显微镜、载玻片4. 酒精灯、镍铬丝接种棒5.培养皿（直径 100mm）、试管（5x150mm）,吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、 2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶培养基及染色剂的制备：1•乳糖蛋白胨培养液:将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节溶液pH为7.2—7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀，分装 于试管中，于121°C高压灭菌器中灭菌15m in,贮存于冷暗处备用2.三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。
除蒸馏水外， 各组分用量增加至三倍3. 品红亚硫酸钠培养基（1） 贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20—30g琼脂加到900mL蒸馏水 中，加热溶解，然后加入3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补 充到lOOOmL，调节溶液pH至7.2—7.4趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加10g乳糖，混匀， 定量分装于250或500mL锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121°C灭菌15min,贮存于冷暗 处备用2） 平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化根据锥形瓶内培养基的 容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌试管中；再按比例 称取无水亚硫酸钠，置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸 lOmin （灭菌）用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深 红色再退至淡红色为止（不宜加多）将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分 混匀（防止产生气泡）立即将此培养基适量（约15mL）倾入已灭菌的平皿内，待冷却凝 固后，置于冰箱内备用，但保存时间不宜超过两周如培养基已由淡红色变成深红色，则不 能再用。
4. 伊红美蓝培养基（1） 贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20—3Og琼脂加到900mL蒸馏水 中，加热溶解再加入2g磷酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL， 调节溶液pH值至7.2—7.4趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装 于250或500mL锥形瓶内，于121C高压灭菌15min,贮于冷暗处备用2） 平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化根据锥形瓶内培养基的容量， 用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液（0.4g伊红溶于20mL水中）和 一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于13mL水中），加入已融化的贮备培养基 内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝 固后，置于冰箱内备用5. 革兰氏染色剂(1) 结晶紫染色液：将20mL结晶紫乙醇饱和溶液(称取4—8g结晶紫溶于100mL95% 乙醇中)和80mL1%草酸铵溶液混合、过滤该溶液放置过久会产生沉淀，不能再用2) 助染剂：将1g碘与2g碘化钾混合后，加入少许蒸馏水，充分振荡，待完全溶解 后，用蒸馏水补充至300mL。
此溶液两周内有效当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去 为易于贮备，可将上述碘与碘化钾溶于30mL蒸馏水中，临用前再加水稀释3) 脱色剂： 95%乙醇4) 复染剂：将0.25g沙黄加到10mL95%乙醇中，待完全溶解后，加90mL蒸馏水四、测定步骤1.生活饮用水(1) 初发酵试验：在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或 烧瓶中(内有倒管)，以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL在10支装有已灭菌的 5mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中(内有倒管)，以无菌操作加入充分混匀的水样 10mL，混匀后置于37°C恒温箱内培养24h2) 平板分离：上述各发酵管经培养24h后，将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接 种于伊红美蓝培养基或品红亚硫酸钠培养基上，置于37C恒温箱内培养24h，挑选符合下列 特征的菌落① 伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光 泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落② 品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属 光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落3)取有上述特征的群落进行革兰氏染色①用已培养18—24h的培养物涂片，涂层要薄。
②将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，lmin后用水洗去③ 滴加助染剂，lmin后用水洗去④ 滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约20—30s），用水洗去⑤ 滴加复染剂，lmin后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者 为阴性菌4.复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另 一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同 一初发酵管（瓶）的最典型菌落1—3个，然后置于37°C恒温箱中培养24h,有产酸、产气 者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在根据证实有大肠菌群存 在的阳性管（瓶）数查后附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数2.水源水（1） 于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入10mL水样；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL 水样；再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL1： 10稀释的水样共计15管，三个稀释度将各管充分混匀，置于37C恒温箱内培养24h。
2） 平板分离和复发酵试验的检验步骤同“生活饮用水检验方法”3） 根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查后附表2“最可能数（MPN）表”，即求 得每100mL水样中存在的总大肠菌群数我国目前系以1L为报告单位，故MPN值再乘以 10,即为1L水样中的总大肠菌群数例如，某水样接种10mL的5管均为阳性；接种1mL的5管中有2管为阳性；接种1： 10的水样1mL的5管均为阴性从最可能数（MPN）表中查检验结果5-2-0，得知100mL 水样中的总大肠菌群数为49个，故1L水样中的总大肠菌群数为49x10=490个对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作1： 10、 1： 100、 1： 1000或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法如果接种的水样量不是10mL、ImL和O.lmL，而是较低或较高的三个浓度的水样量, 也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100mL的MPN值MPNffi皿隔酬接种量£罂弐显）表1大肠菌群检数表接种水样总量300mL（100mL2份，10mL10份）MmL.水量的阳性背数1如mLTk量的阳性頓数0121L水样中大肠菌群数1匸水样中大肠蔺群數1L水样中大肠麓群数0< 3.411138102713273111838414诅4S251830706聽36眈.727431208：31511619'3660230104069.鬼命表2最可能数（MPN）表（接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，不同阳性及阴性情况下100mL水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）出现阳性份数毎IClOmL水样 中綁菌數的最 可能数9衆可信限值ICimL营ImL管□ . ImL営下限上悵000< 2001?.2.< 0 ET0102<05T0204<0.51.L100：.2,< 0 ET1014<0511.，1104<0.515111B<05151206<0515 .2005<0513 ■20171'17童1071.V17古11•5-2■2120g22123012鞋：26■300S1'1530111.2.25-31011■2531114.■4；'343£014■4.34■321IT54633017.54640013331斗□1IT54641017.5：46411£1T殊41q'「97542022-■7B7出现阳性份数毎1 口血匸水 拝中细菌数 的杲可能数茨喘可信' 限值10mL•管ImL管0. ImL.倉TP^.上隈电3 -12&$：7843027g80t3-133.11汨4屯034■is935-口023：7705-0134.1189©0■'-2.-醴:15'11051-033.11935■114&161Z05-：1'笛，63：211505-0 -049,i?13052:17023ITO5• 22942S22:053079.251905-31110'31£505-2 .2 .1403731053；:>180445005斗01303530054.1170431905-'4必，、卫纠577005-•牟■d.-280908505'443501201000550■240687505.5'1洌120100QS5254018014005占；•証92030032005• 5416006405800555> 2400。