1HIV病毒载量检测及耐药分析一、HIV病毒载量（一）HIV病毒载量的概念1987年由John首次提出，它是指病毒的负荷，即在 HIV感染者体内复制病毒的数量感染者体内复制的病毒数量不能够直接检测，一般用血浆中HIV-RNA的拷贝数来代表HIV 的病毒载量二）病毒载量检测的意义1、检测HIV病毒载量可预测疾病的进程HIV疾病进程与病毒载量的关系十分密切，观察感染者病毒载量的水平可以大致预测其发病的可能2、可用于辅助诊断①急性感染辅助诊断在HIV急性感染的早期，会出现抗体的窗口期，此时无法检测到HIV特异性抗体但这时感染者体内的病毒RNA通常会出现一个高峰期因此，采用病毒载量来作为抗体检测的辅助诊断，会避免了由于窗口期而造成的漏检②婴幼儿HIV感染早期诊断宫内感染：HIV阳性的母亲所生的婴儿出生48小时内，进行病毒载量检测，如果检测到病毒核酸，则提示孕期（宫内）感染对18月龄以下幼儿的早期诊断：目前以2次核酸检测结果作为辅助诊断的依据2次不同时间的样本核酸检测如果均为阳性提示为HIV感染，均为阴性提示未感染同时到18个月时做抗体检测，抗体确证阳性方可诊断为HIV感染3、指导治疗方案及评估疗效①CD4细胞计数结合病毒载量检测是决定抗病毒治疗开始的两个非常关键的指标。
HIV感染后并不是在任何情况都要进行抗病毒治疗，通常在病毒载量达到一定水平后（如>35000-50000cps/ml）开始治疗②通过治疗后检测病毒载量的水平来确定治疗是否有效HIV患者在接受治疗后，通常血浆中的病毒载量水平在4周内可下降10倍；在治疗3~6个月后，病毒载量应检测不到，否则可认为治疗效果不佳，甚至治疗失败三）病毒载量的检测方法1、样品的采集和处理①用于HIV病毒载量检测的样品可以为血清、血浆、组织和其他分泌物，有时候还包括生物制品②采集样品应避免微生物和核酸的污染，避免RNA 酶造成的降解，采集后应在4~8个小时内进行处理处理的样品应分装、标记，冻存于-20℃以下，RNA类样品需冻存于-80℃③样品的运送应在低温条件下进行特殊情况下，可用特快专递形式投寄，但必须将盛样品的试管包扎紧固，保证不会破碎和溢漏22、病毒载量的检测方法及质量控制目前用于病毒载量检测方法主要有以下三种：RT-PCR、EasyQ和bDNA 三种方法呢均通过美国FDA认证，但三者检测原理不同①RT-PCR方法•原理RT-PCR是基于HIV-1 RNA形成的CDNA的多聚酶链式反应首先用异硫氰酸胍法提取病毒RNA，用异丙醇沉淀RNA。
使用具有逆转录酶和DNA 聚合酶活性的rTth DNA多聚酶，进行 RNA逆转录，形成cDNA 在生物素标记的HIV引物、rTth DNA多聚酶、脱氧三磷酸核苷和合适的缓冲液成分存在的条件下，cDNA被 PCR扩增到非常高的拷贝数将扩增产物变性，变性后的单链 DNA与微孔板上包被的核苷酸探针结合，被捕获在微孔板上最后加入过氧化物酶标记的亲和素，与扩增产物结合，再加入特异的产色底物，产色底物在过氧化物酶的催化下，就可以发生颜色变化，此时用酶联检测系统就可以读出光密度如果在提取RNA之前每份标本中加入已知拷贝数的标准品定量系统通过比较病毒核酸和标准品扩增产物的光密度，计算出病毒RNA的拷贝数 简而言之，PCR的方法为提取RNA，逆转录酶cDNA，然后对cDNA 进行PCR扩增，形成大量的RNA 拷贝，又将RNA拷贝变性成单链固定在微孔板底部，对固定的DNA进行标记，最后使底物显色 •PCR的基本过程第一步进行HIV-RNA的提取、纯化，裂解病毒包膜释放出RNA，经RNA纯化后，对RNA进逆转录，形成cDNARNA第二步对cDNA进行扩增，利用PCR 的原理进行变性，形成两条 DNA单链检测病毒载量既可预测HIV进程，预测其发病，又可辅助诊断，那如何来进行病毒载量的检测？检测的结果又如何进行解释呢？3经过退火，引物会和DNA单链上的特异性序列相结合。
最后为延伸，通过Tag DNA聚合酶的作用促进引物延伸，完成一次PCR上述PCR过程完成后，原来的一条DNA 双链即可形成两个完全相同的DNA双链，完成一次扩增PCR扩增结果经过一轮循环，一条DNA双链就会形成两条DNA双链；两个循环后，可形成四条PCR过程以2 n倍数进行扩增，如果进行30个循环，最后将得到一个庞大的DNA 数量Target SequencePrimer 1Primer 2 BiotinBiotin5’3’Target SequenceBiotinBiotin4最后为扩增后检测首先要将扩增的DNA双链进行变性，使它成为单链DNA ，然后通过单链DNA与固定在微孔板底部的核糖核苷酸相结合，使变性的DNA 单链被固定在微孔板的底部向其中加入可以和固定的DNA单链结合的氧化酶，并加入底物，在氧化酶的作用下底物会发生颜色反应固定的DNA越多，结合在固定DNA 上的过氧化物酶越多，产生的颜色反应越强定量系统通过比较病毒核酸和标准品扩增产物的量即可定量计算出病毒的拷贝数•RT-PCR特点第一，自动化程度比较高，每次最多检测48个样品第二，亚型覆盖范围广，包括HIV M组的A亚型~G亚型。
第三，RT-PCR动态检测范围是400~750,000 cps/ml，超敏方法检测下限达到50~75,000cps/ml第四，被临床和实验室广泛接受第五，受PCR固有某些因素的影响，如扩增污染，一些血浆成分和抗凝剂可能影响酶活性②NASBA核酸序列扩增系统（NucliSens EasyQ）•EasyQ的原理EasyQ是使用 NASBA技术的扩增试验NASBA技术选择性利用2个引物、 3个酶能够直接扩增病毒RNA而不经过PCR步骤首先用异硫氰酸胍和氧化硅颗粒提取高纯度RNA，RNA通过重复的合成和转录得到扩增具体过程为在AMV-RT的作用下，HIV-1gag区的引物P1 介导由标本RNA合成cDNA，RNA链被RNAse降解引物P2结合启动第二条DNA链合成，形成双链DNA 后，通过T7RNA多聚酶启动RNA的合成，如果这个循环不断重复，就使得HIV 靶RNA在等温条件下得到大量扩增，扩增效率可达到100万到1000万倍扩增后的产物RNA通过Realtime 的方法进行检测如果在RNA提取前即加1 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon5入一定量的拷贝数已知的内标物，定量系统通过样本核酸的测定值与内标物测定值的比较可计算得到样本病毒RNA的拷贝数。
•EasyQ的基本过程首先裂解病毒，提取RNA，硅胶纯化其次为RNA扩增，RASBA中RNA扩增需3个酶、2个引物，其中的引物1具有一段T7 启动子的位点首先引物1与纯化后的RNA 相结合，在逆转录酶的催化下形成DNA-RNA杂核双链，同时核糖核酸酶可将 DNA-RNA杂核双链中的RNA进行切除反应完成后，原来的RNA被全部降解，得到一条DNA 单链引物2与此DNA单链结合，在逆转录酶作用下，形成DNA双链双链形成以后，T7启动，促使T7 RNA聚合酶结合在T7启动子位置，进而启动RNA 的复制经过复制后得到大量的RNA，这些RNA可循环进入下一轮逆转录，形成DNA单链，DNA双链再进行逆转录，如此循环，使RNA得到大量的扩增最后是扩增后实时监测检测，向扩增后的RNA中加入荧光分子信标的物质荧光分子信标是一段人工合成的剪辑序列，一端为荧光基团，另一端是淬灭基团当两端靠近时，荧光基团产生的荧光被淬灭基团所遮蔽，荧光不能显现；随着结合的碱基越来越多，荧光分子信标的颈部被分开，发光基团和淬灭基团距离增加，荧光基团产生的荧光不能被淬灭基团所遮蔽，即可出现荧光通过检测荧光就可以实现对RNA分子的检测，复制的RNA越多，荧光强度就会越大。
如果在RNA提取的过程中，加入已知拷贝数的内标物，随同样本核酸一起提取纯化扩增完成扩增后，内标物会形成一条曲线，定量系统可通过样本核酸的曲线和已知拷贝数内标物所形成的曲线进行比较，最终计算得到样本病毒3’ 5’扩增子5’ 3’ 正义 DNAAMV 逆转录酶核糖核酸酶 HT7RNA 聚合酶引物 1引物 26RNA的拷贝数•NASBA-EasyQ的特点第一，恒温(41℃ )RNA扩增，不需要温度循环第二，选择性RNA扩增，对扩增单链RNA的产物直接进行检测第三，对污染的控制，EasyQ系统采用独立、封闭反应试管，消除扩增后操作步骤，排除交叉污染因素第四，8个一组，每天可以做48个第五，与real-time检测技术相结合，边扩增边检测，大大缩短了检测的时间③ 分支信号放大系统（bDNA）•bDNA原理血浆中的HIV-1 RNA通过信号逐级放大而定量，而不通过扩增，也不需要RNA提取和纯化主要步骤：首先离心浓缩病毒颗粒，然后用去垢剂和蛋白酶K裂解毒粒，释放病毒RNA裂解产物与两组寡核苷酸探针一起孵育，第一组捕获病毒RNA、同时与结合在微孔板上的寡核苷酸探针杂交第二组寡核苷酸探针进行信号放大，它包括4种成分：与靶RNA和预放大探针具有同源性的寡核苷酸靶探针、预放大探针、放大探针和与碱性磷酸酶结合的标记探针。
每一个组分都通过杂交与下一个位点结合，按照这种方式，信号被逐级放大而病毒RNA并没有复制用碱性磷酸酶特异底物通过化学发光进行检测，发光强度与结合的核酸量成正比HIV-1 RNA的绝对量由在同一板上反应的外标曲线来确定，外标曲线即为已知拷贝数的标准品检测形成的曲线 •bDNA基本过程首先裂解病毒颗粒，释放出其中的靶标RNA反应时间荧光强度 目标 RNA内标物7病毒裂解同时灭活病毒RNA酶释放病毒RNA靶标 RNA第二步，病毒RNA的捕获固定通过既可以与病毒RNA结合，又可以与微孔板上寡核苷酸探针结合的捕获探针将病毒RNA固定在微孔板底部同时既能与病毒RNA结合，又能与预扩增探针相结合的靶探针也结合在病毒RNA上，为放大做好准备捕获探针和靶探针同时和靶RNA结合，将其固定于微孔板底部 靶探针捕获探针病毒RNA微孔板包被好的捕获探针第三步，前信号放大分子杂交：加入预放大探针后，预放大探针即可通过靶探针结合在已经固定的病毒RNA上，每个病毒RNA上可以结合若干预放大探针，信号被放大8病毒RNA靶探针每一个预扩增探针必须结果两个靶探针 预扩增探针预扩增探针捕获探针微孔板包被好的捕获探针第四步，信号放大分子杂交：如果再向其中加入放大探针，它选择性地结合在预放大探针上，每一条预放大探针上可以结合大量的放大探针，信号得到进一步的放大。
捕获探针病毒RNA预扩增探针靶探针放大探针放大探针第五步，如再向其中加入磷酸酶标记的标记探针，标记探针与放大探针相结合，每一个放大探针上可结合大量的标记探针，使信号更进一步被放大9靶探针预防大探针病毒RNA捕获探针包被好的捕获探针与放大探针结合后的标记探针碱性磷酸酶表姐的标记探针第六步，向其中加入标记探针作用的底物，在标记探针上碱性磷酸酶的催化作用下，底物产生荧光，进而得到检测通过标本反应强度与标准品强度的比较，确定标本的病毒载量拷贝数 靶探针预防大探针微孔板捕获探针 包被好的捕获探针加入底物及底物增强剂发光光的强度与病毒RNA含量成正比光的强度与病毒RNA含量成正比与放大探针结合后的标记探针•bDNA技术的特点不需要RNA提取、纯化及PCR扩增，避免了提取和扩增核酸可能产生的污染问题没有PCR反应，不受抑制Taq DNA聚合酶因素（如肝素）的影响精确度好，结果数据稳定可靠能够与HIV-1 M 群的A~G 亚型结合10可批量处理样品，。