实 验斯达油脂酵母胞外多糖发酵斯达油脂酵母胞外多糖发酵 主讲：徐尔尼主讲：徐尔尼 生命科学学院生物技术系生命科学学院生物技术系 一、目的要求Ø学习微生物发酵法生产菌体胞外多糖学习微生物发酵法生产菌体胞外多糖Ø学习微生物胞外多糖含量的检测方法学习微生物胞外多糖含量的检测方法 二、基本原理Ø 微微生生物物胞胞外外多多糖糖是是指指分分布布于于细细胞胞壁壁之之外外，，以以荚荚膜膜的的形形式式附附在在细细胞胞壁壁上上或或以以粘粘液液的的形形式式分分泌泌于于胞胞外外环环境境同同型型多多糖糖或或异异多多糖糖许许多多微微生生物物均均能能产产生生胞胞外外多多糖糖，，但但只只有有在在合合适适的的培培养养条条件件下下才才能能大大量量产产生生，，积积累累该该产产物物本本实实验验以以斯斯达达油油脂脂酵酵母母为为生生产产菌菌种种，，选选用用高高碳碳氮氮比比的的液液体体发发酵酵培培养养基基及及高高通通气气量量等等有有利利于于菌菌株株多多糖糖合合成成的的培培养养条条件件进进行行胞胞外外多多糖糖发酵Ø 本本实实验验多多糖糖的的定定量量测测定定采采用用苯苯酚酚－－硫硫酸酸法法, ,多多糖糖在在浓浓硫硫酸酸作作用用下下生生成成糖糖醛醛，，糖糖醛醛能能与与酚酚类类化化合合物物作作用用生生成成有有色色物物质质，，在在490nm490nm处处有有最最大大吸吸收收值值，，且且颜颜色色深深浅浅在在一一定定范范围围内内与与糖糖含含量量呈呈线线性性关关系系，，因因此此可可采采用用分光光度法进行定量测定。
分光光度法进行定量测定 三、实验器材一）菌种一）菌种 斯达油脂酵母斯达油脂酵母( (Lipomyces starkeyiLipomyces starkeyi)2.1390 )2.1390 二）试剂二）试剂 •甘甘露露糖糖标标准准液液（（100ug/mL100ug/mL））：：准准确确称称取取干干燥燥至至恒恒重重的的甘甘露露糖糖，，用蒸馏水溶解并定容至用蒸馏水溶解并定容至100mL100mL•6%6%苯酚溶液（临用前用重蒸酚配制）苯酚溶液（临用前用重蒸酚配制）•浓硫酸浓硫酸•95%95%乙醇乙醇•饱和氯化钾溶液饱和氯化钾溶液•75%75%乙醇乙醇 二）试剂二）试剂• 费费林林试试剂剂A A（（硫硫酸酸铜铜溶溶液液））：：将将g g结结晶晶硫硫酸酸铜铜溶溶于于500mL500mL蒸蒸馏馏水中，加水中，加浓硫酸，混合均匀浓硫酸，混合均匀• 费费林林试试剂剂B B（（酒酒石石酸酸钾钾钠钠碱碱性性溶溶液液））：：将将125125g g氢氢氧氧化化钠钠和和137137g g酒石酸钾钠溶于酒石酸钾钠溶于500mL500mL蒸馏水中，贮于带橡皮塞的瓶内蒸馏水中，贮于带橡皮塞的瓶内。
三）三）培养基培养基• 斜面培养基：斜面培养基：蔗糖蔗糖2%2%，酵母膏，酵母膏0.5%0.5%，琼脂，琼脂1.8%1.8%，，• 种子培养基：种子培养基：蔗糖蔗糖2%2%，酵母膏，酵母膏0.5%0.5%，，• 发发酵酵培培养养基基：：蔗蔗糖糖8%8%，，蛋蛋白白胨胨0.3%0.3%，，K K2 2HPOHPO4 4··3H3H2 2O O 0.35%0.35%，，KHKH2 2POPO4 4 0.35% 0.35%，无机盐溶液，无机盐溶液0.5%0.5%（（V/VV/V），），• 无无 机机 盐盐 溶溶 液液 ：： MgSOMgSO4 4··7H7H2 2O O 0.4%0.4%，， MnSOMnSO4 4··H H2 2O O 0.2%0.2%，，FeSOFeSO4 4··7H7H2 2O 0.2%O 0.2%，，NaCl0.2% NaCl0.2% 三、实验器材 三、实验器材四）玻璃器皿及其它物品四）玻璃器皿及其它物品 刻刻度度吸吸管管1ml1ml、、 2ml2ml、、 5ml5ml、、10ml10ml，，150ml150ml三三角角瓶瓶、、250ml250ml三三角角瓶瓶、、250ml250ml量量筒筒、、1818×180×180试试管管、、pHpH精精密密试试纸纸、、纱纱布布、、牛牛皮纸、接种环、移液枪、酒精灯皮纸、接种环、移液枪、酒精灯五）仪器五）仪器 高高压压灭灭菌菌锅锅、、振振荡荡培培养养箱箱、、722722型型分分光光光光度度计计、、电电热热恒恒温温水浴锅、离心机水浴锅、离心机 三、实验器材每组实验器材：（每组实验器材：（每组实验器材：（每组实验器材：（4 4人人人人/ /组）组）组）组） 250ml 250ml三角瓶三角瓶 1 1个、刻度吸管个、刻度吸管1ml 31ml 3支、支、 2ml 3 2ml 3支、支、 5ml 3 5ml 3支、支、10m 310m 3支，支，1818×180×180试管试管 10 10支、纱布、牛皮纸等。
支、纱布、牛皮纸等 四、实验步骤配制发酵培养基配制发酵培养基 灭菌灭菌 接接种、发酵培养种、发酵培养 发酵液的处理发酵液的处理 多糖的提取多糖的提取 甘露糖标准曲线的制作甘露糖标准曲线的制作 发酵发酵液多糖的测定液多糖的测定 发酵液中胞外多糖含发酵液中胞外多糖含量计算量计算 五、实验内容一）配制培养基：（一）配制培养基：（4人人/组）组）• 发发酵酵培培养养基基蔗蔗糖糖8%8%，，蛋蛋白白胨胨0.3%0.3%，，K K2 2HPOHPO4 4··3H3H2 2O O 0.35%0.35%，，KHKH2 2POPO4 4 0.35% 0.35%，无机盐溶液，无机盐溶液0.5%0.5%（（V/VV/V），），配配50mL50mL））• 无无 机机 盐盐 溶溶 液液 ：： MgSOMgSO4 4··7H7H2 2O O 0.4%0.4%，， MnSOMnSO4 4··H H2 2O O 0.2%0.2%，，FeSOFeSO4 4··7H7H2 2O 0.2%O 0.2%，，NaCl0.2% NaCl0.2% 。
全班全班配配200mL200mL））培养基配制步骤：培养基配制步骤：称量称量→→加水加水→→加热溶化加热溶化→→调调pH→pH→分装分装 配配制制好好的的种种子子和和发发酵酵培培养养基基分分装装在在150mL150mL和和250mL250mL的的三三角角烧烧瓶瓶中中，，装装量量为为30mL30mL，，用用8 8层层纱纱布布展展平平包包于于瓶瓶口口，，再再用用牛牛皮皮纸纸包包扎扎，，贴上标签，写好组名贴上标签，写好组名 五、实验内容二）培养基和实验器材料的灭菌处理• 培养基灭菌培养基灭菌 取已分装并包扎好的培养基，置灭菌锅取已分装并包扎好的培养基，置灭菌锅1211210 0C C灭菌灭菌20min20min 五、实验内容高压蒸汽灭菌法操作步骤如下：高压蒸汽灭菌法操作步骤如下：高压蒸汽灭菌法操作步骤如下：高压蒸汽灭菌法操作步骤如下：1. 1. 1. 1. 将灭菌器内加入一定量的水，把待灭菌的物品放入其中；将灭菌器内加入一定量的水，把待灭菌的物品放入其中；将灭菌器内加入一定量的水，把待灭菌的物品放入其中；将灭菌器内加入一定量的水，把待灭菌的物品放入其中；2. 2. 2. 2. 接通电源加热；接通电源加热；接通电源加热；接通电源加热；3. 3. 3. 3. 排除高压锅内的冷空气；可将排气阀打开，待排出大量汽排除高压锅内的冷空气；可将排气阀打开，待排出大量汽排除高压锅内的冷空气；可将排气阀打开，待排出大量汽排除高压锅内的冷空气；可将排气阀打开，待排出大量汽体后关闭排气阀，或关闭排气阀，当压力上升到体后关闭排气阀，或关闭排气阀，当压力上升到体后关闭排气阀，或关闭排气阀，当压力上升到体后关闭排气阀，或关闭排气阀，当压力上升到2 2 2 2时再打开排时再打开排时再打开排时再打开排气阀，待压力回复到气阀，待压力回复到气阀，待压力回复到气阀，待压力回复到0 0 0 0时再关闭排气阀；时再关闭排气阀；时再关闭排气阀；时再关闭排气阀；4. 4. 4. 4. 当压力达当压力达当压力达当压力达2 2 2 2时，此时灭菌器内的温度为时，此时灭菌器内的温度为时，此时灭菌器内的温度为时，此时灭菌器内的温度为121℃121℃121℃121℃，维持，维持，维持，维持20min20min20min20min；；；；5. 5. 5. 5. 灭菌维持时间到了，切断电源，待压力降至零时，才能打灭菌维持时间到了，切断电源，待压力降至零时，才能打灭菌维持时间到了，切断电源，待压力降至零时，才能打灭菌维持时间到了，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品；开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品；开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品；开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品； 五、实验内容三）发酵培养三）发酵培养 1 1、接种、接种 取取移移液液枪枪，，采采用用无无菌菌操操作作吸吸取取斯斯达达油油脂脂酵酵母母种种子子培培养养液，接入发酵培养基中。
液，接入发酵培养基中 2 2、发酵培养、发酵培养 将将已已接接菌菌的的发发酵酵培培养养基基置置振振荡荡培培养养箱箱内内，，28280 0C C、、120r/min120r/min，培养，培养108h108h，得斯达油脂酵母多糖发酵液得斯达油脂酵母多糖发酵液 五、实验内容四）发酵液的处理四）发酵液的处理 将装有发酵液的三角烧瓶从振荡培养箱中取，用吸管吸取将装有发酵液的三角烧瓶从振荡培养箱中取，用吸管吸取发酵液发酵液5ml5ml，置，置离心管离心管内，内， 3500r/min 3500r/min离心离心15min15min除菌体五）胞外多糖的提取五）胞外多糖的提取 1 1、多糖的粗提、多糖的粗提 取离心上清液取离心上清液2ml2ml，置，置离心管离心管中，加蒸馏水中，加蒸馏水4ml4ml（稀释（稀释3 3倍），倍），调取1ml1ml稀释液，置稀释液，置离心管离心管中，加中，加95%95%乙醇乙醇3mL3mL，氯化钾饱和，氯化钾饱和液液1 1滴，混匀滴，混匀3500r/min3500r/min离心离心10min10min，弃上清液。
沉淀即为多，弃上清液沉淀即为多糖粗提物糖粗提物 2 2、多糖的洗涤、多糖的洗涤 沉淀加沉淀加75%75%乙醇乙醇5ml5ml，振荡混匀洗涤，，振荡混匀洗涤， 3500r/min 3500r/min离心离心5min5min，弃上清液沉淀再加，弃上清液沉淀再加75%75%乙醇乙醇5ml5ml，振荡混匀洗涤，，振荡混匀洗涤， 3500r/min3500r/min离心离心5min5min（洗涤二次）洗涤二次）直至上清液无还原糖直至上清液无还原糖反应反应，如无还原糖反应则将上清液倾去，，如无还原糖反应则将上清液倾去，沉淀沉淀即为胞外多即为胞外多糖将沉淀溶于蒸馏水中并糖将沉淀溶于蒸馏水中并稀释至适当浓度稀释至适当浓度（加（加8mL8mL蒸馏蒸馏水振荡充分溶解）水振荡充分溶解）为样品液为样品液 五、实验内容六）甘露糖标准曲线的制作甘露糖标准曲线的制作 取取6 6支干净试管，分别加入支干净试管，分别加入100ug/mL100ug/mL甘露糖标准溶液甘露糖标准溶液0 0、、 、、 、、 、、 、、 1.0ml 1.0ml，不足，不足1ml1ml管加蒸馏水补足至管加蒸馏水补足至1ml1ml，各管，各管加加6%6%苯酚溶液，摇匀，再加入浓硫酸，混匀静置苯酚溶液，摇匀，再加入浓硫酸，混匀静置10min10min，然，然后在后在25-3025-300 0C C水浴中放置水浴中放置20min20min，取出。
用，取出用1cm1cm玻璃吸收池，以玻璃吸收池，以空白管溶液为对照组，在波长空白管溶液为对照组，在波长490nm490nm处依次测定各管溶液的处依次测定各管溶液的光密度值（光密度值（ODOD） 以以甘露糖浓度甘露糖浓度为横坐标，为横坐标，光密度值光密度值为纵坐标，绘制甘露为纵坐标，绘制甘露糖标准曲线糖标准曲线注意要点：试管和吸管要冼干净，取样要准确注意要点：试管和吸管要冼干净，取样要准确 五、实验内容七）样品液多糖的测定样品液多糖的测定 取取1 1支干净试管，加样品液，蒸馏水，支干净试管，加样品液，蒸馏水，6%6%苯酚溶液，摇匀，苯酚溶液，摇匀，再分别加入浓硫酸，混匀静置再分别加入浓硫酸，混匀静置10min10min，然后在，然后在25-3025-300 0C C水浴中放置水浴中放置20min20min，取出用，取出用1cm1cm玻璃吸收池，以甘露糖空白管溶液为对照玻璃吸收池，以甘露糖空白管溶液为对照组，在波长组，在波长490nm490nm处测定溶液的光密度值（处测定溶液的光密度值（ODOD） 根据甘露糖标准曲线，求出样品液中每毫升甘露糖的微克根据甘露糖标准曲线，求出样品液中每毫升甘露糖的微克数。
数注意要点：注意要点： 加入苯酚和浓硫酸处理后，待测试管内溶液颜色的深浅最好在甘露糖标加入苯酚和浓硫酸处理后，待测试管内溶液颜色的深浅最好在甘露糖标准溶液试管颜色的深浅变化之间准溶液试管颜色的深浅变化之间 八）发酵液胞外多糖含量的计算八）发酵液胞外多糖含量的计算胞外多糖胞外多糖ug/ml = ug/ml = 从标准曲线查得的甘露糖微克数从标准曲线查得的甘露糖微克数×× 稀释倍数稀释倍数 六、实验数据及处理结果实验数据及处理结果 u 记录实验操作步骤及实验数据记录实验操作步骤及实验数据u 计算发酵液中胞外多糖的含量计算发酵液中胞外多糖的含量 七、思考与讨论思考与讨论 为什么在高碳氮比的液体培养基中及高通气量进行为什么在高碳氮比的液体培养基中及高通气量进行发酵有利于菌株多糖的合成？发酵有利于菌株多糖的合成？ 实验报告格式实验报告格式一、实验项目名称一、实验项目名称二、实验目的二、实验目的三、实验基本原理三、实验基本原理四、主要仪器设备及耗材四、主要仪器设备及耗材五、实验步骤五、实验步骤六、实验数据及处理结果六、实验数据及处理结果七、思考讨论题七、思考讨论题 五、实验内容无还原糖反应测定步骤如下：无还原糖反应测定步骤如下：1. 1. 取二支干净试管，各加入取二支干净试管，各加入1ml1ml费林试剂费林试剂A A和和1ml1ml费林试剂费林试剂B B，混，混匀。
匀2. 2. 其中一支试管加其中一支试管加75%75%乙醇乙醇1ml 1ml ，另一支试管加，另一支试管加75%75%乙醇样品洗乙醇样品洗涤液涤液1ml 1ml 3. 3. 二支试管放入沸水浴中加热二支试管放入沸水浴中加热2-3min2-3min，取出冷却，观察是否有，取出冷却，观察是否有红色沉淀生成红色沉淀生成还原糖反应测定原理：还原糖反应测定原理： CHO COONa（（CHOH））4 + 2Cu（（OH））2+ NaOH 加热加热 （（CHOH））4 + 2Cu2O ↓↓（红色）（红色） CH2OH CH2OH 。