一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞 1．取 6 周左右的小鼠（或 600 克左右的豚鼠，或 3 公斤左右的家兔） ，剃去腹部的毛并消 毒腹腔注射 1ml（豚鼠 20ml，家兔 200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或 4％淀粉 肉汤3～4 天以后收集腹腔细胞 2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始放血处死动物，以 减少腹腔中的红细胞消毒腹部，沿腹中线注入 3～4ml（豚鼠 20～40ml，家兔 50～70ml）冰中预冷的无菌 PBS-H（含 10U/ml 肝素和 10％小牛血清的 PBS） 轻轻按摩 腹部 5 分钟 3．以下均无菌操作剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷 PBS-H 冲洗腹 腔 2～3 次合并渗出液于离心管中，4℃离心 250×g 10 分钟，去上清液 4．用预冷的 RPMI-1640 培养液洗涤细胞 3 次，每次 4℃离心 250×g 10 分钟，去上清液 用预冷的适量 RPMI-1640 培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化 1．取 2～3 公斤重的家兔，耳缘静脉注射 10ml 空气处死动物或注射 2ml（含 130mg）戊 巴比妥麻醉动物。
仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁以下过程注意无菌操作小心从环状 软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织用无菌纱布小心擦 净肺表面，称重 2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空向气管中注射 40ml 无菌的冷生理盐 水，让生理盐水进入全部肺泡用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒 入离心管中再用同样方法，用 40ml 无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置 4℃ 3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷 RPMI-1640 培养液的平皿中平皿置冰上，用吸满冷 RPMI-1640 培养液的 20ml 注射器接 23 号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离使肺组织 通过 00 目的钢丝网，分离单个细胞 4．以下过程均在 4℃中进行分别处理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞：离心 200×g 10 分钟，去上清液轻弹试管，悬浮细胞，加入 10ml 低渗液（20mmol/L Tris, 0.75%氯 化铵，pH7.4） ，37℃处理 3～5 分钟，溶解红细胞红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组 织巨噬细胞的 1％和 10％。
也可以不用低渗处理，直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞5．离心 200×g 10 分钟，去上清液用 RPMI-1640 培养液洗涤细胞一次将细胞悬液加 在淋巴细胞分离液（比重 1.077）上，离心 400×g 20 分钟，收集交界面的巨噬细胞弃去 沉淀的死细胞和红细胞 6．用 RPMI-1640 培养液洗涤巨噬细胞 2 次台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数，将细胞 配成所需浓度此时巨噬细胞活力可达 90％以上，巨噬细胞占全部细胞的 90％以上 三、从小鼠脾脏、胸腺和骨髓中分离巨噬细胞 1．用外科方法无菌摘取小鼠脾脏和胸腺，置于盛有预冷 RPMI-1640 培养液（含 1％小牛 血清）的平皿中，剪去结缔组织和脂肪用无菌注射器芯将脾脏或胸腺挤压通过 200 目的 钢丝网，获得单个细胞 2．离心 200×g 10 分钟，去上清液用含 1％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞配成 约 1×108～5×108/ml巨噬细胞的纯化一、用帖壁法纯化巨噬细胞 1．用含 20％～40％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将巨噬细胞配成 2×106～4×106/ml 的 浓度以每平方厘米 2×105～4×105 个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿（瓶） 或塑料培养皿（瓶）中。
37℃ 5％ CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 1 小时或 24 小 时1 小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞，而 24 小时可以得到较多的巨 噬细胞20％～40％的小牛血清可以减少 B 淋巴细胞的粘附 2．摇晃培养皿（瓶） ，悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液用预温的 Hanks 液洗涤细胞 3～4 次悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞用适量含 2.5mmol/L EDTA 的无钙镁 Hanks 液消化细胞 37℃ 15～30 分钟用吸管吹打分离细胞，离心 250×g 10 分钟，去上 清液 3．用预冷的 Hanks 液洗涤细胞 3～4 次，每次离心 250×g 10 分钟，去上清液最后用含 10％小牛血清的 RPMI-1640 培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力，将 细胞配成所需的浓度二、用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞 1．取 15ml 离心管，将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上淡的顺序依次分层加在离心 管中，每个浓度 2ml最后加上上述巨噬细胞悬液 3～5ml（约含 2×107～5×107 细胞） 2．4℃中，水平离心 1000×g 30 分钟，垂直取出离心管，小心吸出各交界面的细胞。
分别 用预冷的含 1％小牛血清 RPMI-1640 培养液洗涤各交界面细胞 2 次，每次 200×g 10 分钟 用含 10％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞配成所需的浓度巨噬细胞培养 1．实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤 1ml（勿注入肠内） 2．引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入 70％酒精中 3～5 秒 3．置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但 勿伤及腹膜壁 4．再用 70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸 10ml Eagle 液注入腹腔中，同时从两侧用手 指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动 5．用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内6．小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g 4℃离心 10 分钟，去上清，加 10 ml Eagle 培养基 7．计数细胞，每只小鼠可产生 20～30×105 细胞，其中 90％为巨噬细胞 8．为获取 3×105 个帖附细胞/平方厘米，需接种 2.5×106/ml 9．为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用 Eagle 液冲洗 1～2 次后，再加新 Eagle 培养液置 37℃ CO2 温箱中培养。