论文答辩日期梁晶晶学科专业亟随兽医堂指导教师星廷苤数援2 0 1 0 ．0 6 ．0 6学位授予日期答辩委员会主席整玉曩硒究员论文评阅人蔓窆民数援蕉挂羞塾援本人声关知识产权的研究内容本人为获得其它学位而使用过的内容对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢论文作者签名：一一浆‰、孙学位论文使用授权说明W 缈年占月，p 日本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容请选择发布时间：幽／时发布口解密后发布( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 敝储签锄燧名：、磷叼刖月t v猪瘟猪瘟是一种以严重出血为特征、高度接触感染性的动物疫病，能够导致猪群的大量发病和死亡，给养猪业造成严重的经济损失E 2囊膜糖蛋白是猪瘟病毒中相当重要的一个结构蛋白，其不仅参与了病毒的感染致病过程，还是病毒的主要保护性抗原，能够诱生特异性的中和抗体清除病毒因此，对E 2 蛋白结构和功能的探索一直是猪瘟病毒研究的重点之一。
本文根据己发表猪瘟病毒兔化弱毒株的E 2 基因序列，设计引物利用R T - P C R 方法扩增了E 2 基因的主要抗原结构域E 2 a ，并将其克隆至p M D l 8 一T 载体，再亚克隆到原核表达载体p E T - 3 2 a 上，构建重组表达质粒p E T - E 2 a 将p E T - E 2 a 转入大肠杆菌B L 一2 1 ( D E 3 ) 与R o s e t t a ( D E 3 ) 中进行I P T G 诱导表达，表达产物经S D S ．P A G E 与W e s t e r nb l o t 检测，证实为E 2 a 重组融合蛋白E 2 a 重组蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达，而R o s e t t a ( D E 3 ) 菌株中的蛋白表达量显著高于B L ．2 1 ( D E 3 ) 菌株所得包涵体溶解后经镍离子金属螯合亲和层析法进行纯化，纯化蛋白以逐步透析法进行复性重折叠，通过W e s t e r nb l o t 实验证实复性蛋白可被猪瘟阳性血清识别，具备良好的抗原性以复性E 2 a 重组蛋白制备抗原免疫动物，获取了多克隆抗体免T疫斑点实证实针对细胞中天性。
关键词：C S F VE 2 蛋白原核表达亲和层析纯化多克隆抗体I Ig l y c o p r o t e i ni so n eo ft h ei m p o r t a n ts t r u c t u r a lp r o t e i n so fC S F V ．T h eE 2g l y c o p r o t e i ni sn oo n l yt h em a i nt a r g e tf o rn e u t r a l i z i n ga n t i b o d i e sb u ta l s o r e f e rt oC S F Vi n f e c t i o na n dp a t h o g e n i c i t y ．T h u s ，t h ek n o w l e d g ea b o u tt h eE 2g l y c o p r o t e i ni st h em a i np o i n t so fr e s e a r c hc o n c e r n e dw i t hC F S VT h ea n t i g e n i cr e g i o n si nE 2g e n e ( E 2 a ) o fC S F VH C L Vs t a i nw a sa m p l i f i e db yR T - P C Ra n dc l o n e di n t op M D18 一Tv e c t o r , a n dt h e ns u b s e q u e n tc l o n e di n t op E T - 32 ap r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r , o b t a i n e dar e c o m b i n a n tp l a s m i dp E T - E 2 a ．T h e nt r a n s f o r m e dp E T - E 2 ap l a s m i di n t oE ．c o l iB L - 21 ( D E 3 ) a n dR o s e t t a ( D E 3 ) ．T h eE 2 ap r o t e i n se x p r e s s e di nE ．c o l iw a sv e r i f i e db yS D S - P A G Ea n dw e s t e r nb o l ta n a l y s i sa f t e ri n d u c t i o nb yI P T GT h ef u s i o np r o t e i ne x p r e s s e di nE ．c o l iw a sa saf o r mI I Io fi n c l u s i o nb o d y ．I tw a ss h o w e dt h a tR o s e t t a ( D E 3 ) h a de x c e l l e n t e re x p r e s s i o na b i l i t yt h a nB L 21 ( D E 3 ) ．T h er e c o m b i n a n tE 2 ap r o t e i nw a sp u r i f i e dv i aN i - c h e l a t i n gh i st r a pa f f i n i t yc o l u m na n dt h e nr e f o l d e di t ．T h er e f o l d e dE 2 ap r o t e i n sc o u l db ed e t e c t e db ys w i n ea n t i - C S F Vs e r u mu s i n gw e s t e mb l o ta n a l y s i s ．T h eE 2 ar e c o m b i n a n tp r o t e i nw a su s e da sa l la n t i g e nt oi m m u n i z et h em i c e ．P o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tE 2 a w a sp r e p a r e da f t e ri m m u n i z e dm i c ef o rf o u rt i m e s ．T h et i t e r a t i o no fp o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tE 2 aw a sd e t e r m i n e du s i n gd o tb l o ta s s a y , a n dt h e ne v a l u a t et h eb i n d i n ga c t i v i t yb e t w e e np o l y c l o n a la n t i b o d ya n dC S F VE 2p r o t e i nu s i n gw e s t e r nb l o ta n a l y s i sa n di n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c ea n a l y s i s ．T h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h i sp o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tE 2 ac o u l dr e c o g n i z et h eC S F Vv i r i o na n dEl ／E 2p r o t e i nh e t e r o d i m e r ．K E YW O R D S ：C S F VE 2p r o t e i n ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h ；p o l y c o n a la n t i b o d yI V1 ．2 ．3E 2 蛋白的功能研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1O1 ．2 ．4 以E 2 蛋白为基础的疫苗研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。
1 11 ．2 ．5E 2 蛋白在不同系统的表达研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 31 ．3 目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 62 ．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 ．1 技术路线与质粒构建策略⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172 ．1 ．1 实验技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 72 ．1 ．2 重组质粒构建策略⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 82 ．2 主要试剂与仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 92 ．2 ．1 质粒构建主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 92 ．2 ．2 蛋白提纯主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 92 ．2 ．3 蛋白鉴定与抗体检测主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 92 ．2 ．4 主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．192 ．3 毒株、质粒与菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 92 ．3 ．1 毒株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 92 ．3 ．2 质粒载体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 02 ．3 ．3 菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 0V．■111l211l ，l1 l2 ．6 ．2 目的基因与原核表达载体的连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 52 ．6 ．3 转化方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 52 ．6 ．4 重组表达质粒的筛选与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 52 ．6 ．5 转化表达菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 52 ．7 重组蛋白的表达与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 52 ．7 ．1 蛋白的诱导表达与条件优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 52 ．7 ．2 表达产物的S D S ．P A G E 检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 62 ．7 ．3 重组蛋白的W e s t e r nb l o t 鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 72 ．7 ．4 重组蛋白表达形式的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 82 ．8 重组蛋白的纯化与复性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 92 ．8 ．1 包涵体的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 92 ．8 ．2 包涵体的复性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一3 02 ．8 ．3 纯化复性蛋白的W e s t e r nb l o t 鉴定⋯。