实验二实验二 蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定――――双缩脲法双缩脲法目的要求目的要求学习双缩脲法测定蛋白质的原理和方法原理原理具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2＋形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，故可用来测定蛋白质的浓度试剂和器材试剂和器材一、测试样品⒈ 标准蛋白溶液10mg/ml 牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用 0.05M 氢氧化钠溶液配制） 作为标准用的蛋白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度称量、配制成标准溶液⒉ 测试样品液人（鸭）血清（稀释 10 倍） 测定其它蛋白样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内二、试剂双缩脲试剂：将 0.175g 硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于 15ml 蒸馏水，置于 100ml 容量瓶中，加 30ml 浓氨水，30ml 冰冷的蒸馏水和 20ml 饱和 NaOH 溶液，摇匀，室温放置 1－2小时，再以蒸馏水定容至 100ml 后，摇匀，备用三、器材试管、试管架、恒温水浴、752 型分光光度计操作方法操作方法一、标准曲线的绘制取 6 支干试管，按下表操作012345标准蛋白液(ml)00.20.40.60.81.0蛋白浓度(mg/ml)02.04.06.08.010.0蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20.0双缩脲（ml）4.04.04.04.04.04.0充分混匀后，室温下（20－25℃）放置 30 分钟测 A540值以 A540为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘制标准曲线。
二、样品测定取 2 支试管，按下表操作试管01血清稀释液（ml）00.5蒸馏水（ml）1.00.5双缩脲（ml）4.04.0充分混匀后，室温下（20－25℃）放置 30 分钟A540三、计算血清样品蛋白质含量（g/100ml 血清）＝×10－3×100VNY 固体样品蛋白质含量（％）＝×100％cNY 其中，Y 为标准曲线查得蛋白质的浓度（mg/ml） ，N 为稀释倍数，V 为血清样品所取得体积（ml） ，c 为样品原浓度注意事项注意事项（1）本法应用范围，因不同书籍报道，数值不一本实验测定范围 1－10mg 蛋白质2）须于显色后 30 分钟内比色测定30 分钟后，可有雾状沉淀发生各管由显色到比色的时间应尽可能一致3）有大量脂肪性物质存在时，会产生混浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取清液再测定。