葡萄柚成熟果实气味对桔小实蝇雌虫的引诱及其化学成分 申建梅 凌志强 陆永跃 陈炳翰 胡黎明 仲恺农业工程学院农业与生物学院 华南农业大学农学院 摘 要： 采用 Y 型嗅觉仪测定了葡萄柚成熟果实气味对桔小实蝇 Bactrocera dorsalis雌成虫的引诱活性, 同时, 采用固相微萃取技术对葡萄柚成熟果实的挥发性物质进行收集, 并运用气相色谱-质谱联用技术 (GC-MS) 对其化学成分进行分析结果表明, 葡萄柚成熟果实气味对桔小实蝇雌成虫具有明显的引诱作用, 挥发物主要成分为 5 种相对含量大于 0.5%的烯类物质: (+) -柠檬烯 (45.52%) 、月桂烯 (4.09%) 、 (1R) - (+) -α 蒎烯 (1.28%) 、β-石竹烯 (0.64%) 和萜品油烯 (0.61%) 推测这些物质是葡萄柚成熟果实引诱桔小实蝇雌成虫的主要活性成分关键词： 桔小实蝇; 葡萄柚; Y 型嗅觉仪; 固相微萃取; 气质联用; 作者简介：申建梅 (1979—) , 女, 博士, 副教授, 从事昆虫行为学研究E-mail:shenjianmei12@作者简介：胡黎明 (1978—) , 男, 博士, 副教授, 从事昆虫行为学和化学生态学研究。
E-mail:huliming98@收稿日期：2017-08-15基金：广东省省级科技计划项目 (2014A020208129) Received： 2017-08-15桔小实蝇 Bactrocera dorsalis 能取食 40 多科 250 多种水果和蔬菜[1-3]其主要是以雌成虫产卵于果皮下, 幼虫孵化后直接取食果肉, 从而造成烂果和落果目前对桔小实蝇的防治方法主要有诱杀和化学防治化学防治不但存在环境安全和食用安全风险问题, 而且近年来桔小实蝇已对多种化学农药产生抗性, 致使防治效果下降[4-5]诱杀主要使用类性引诱剂甲基丁香酚、水解蛋白和植物提取物等其中, 常用的甲基丁香酚主要是引诱桔小实蝇雄虫, 并且甲基丁香酚还可能对生态平衡和哺乳动物健康有负面影响[6], 而根据桔小实蝇为害特点, 诱杀雌虫更利于控制其为害[7]因此, 从寄主和非寄主植物的叶片或果实中筛选对桔小实蝇雌虫具有较高引诱活性的物质进而开发新型引诱剂受到广泛关注植物挥发物在害虫搜寻寄主和产卵的过程中起着非常重要的作用[8]已有研究表明, 多种果实挥发物对桔小实蝇雌虫具有引诱作用[9-10]葡萄柚 (商品名西柚) Citrus paradisi, 属芸香科水果[11]。
在生产中观察到, 成熟西柚对桔小实蝇雌虫具有明显的引诱效果, 说明成熟西柚挥发物中存在引诱桔小实蝇雌虫的化学物质为探明成熟西柚对桔小实蝇雌虫具有引诱活性的挥发性物质, 笔者利用 Y 型嗅觉仪检测桔小实蝇雌虫对成熟西柚的行为选择反应, 利用固相微萃取技术对其挥发物进行收集, 运用气相色谱-质谱联用技术 (SPME-GC-MS) 进行分析1 材料与方法1.1 材料桔小实蝇幼虫采用人工饲料进行室内饲养饲养条件为:温度 (27±1) ℃, 相对湿度 50%~70%, 光周期 L∶D=12 h∶12 h选用饥饿处理的产卵期雌虫作为供试虫源试验用成熟西柚购自市场, 洗净后将果肉和果皮匀浆后用于后续测试1.2 主要仪器Y 型嗅觉仪:由味源瓶、空气加湿器、活性碳空气过滤装置和 Y 型管组成, 各部件之间以硅胶管连接嗅觉仪的 2 个侧臂长为 20cm, 直管长 30cm, 两臂夹角为75°气相色谱-质谱联用仪:TRACE GC2000/TRACE MS, 购自美国 Thermo Finnigan 公司顶空微萃取仪:由 SPME 手动进样手柄和 75μm 的 CAR/PDMS 微萃取头组成, 购自Supelco 公司。
1.3 测定方法1.3.1 雌虫对西柚气味选择的测定采用 Y 型嗅觉仪测定桔小实蝇雌成虫对成熟西柚果实的嗅觉选择行为测试时, 将嗅觉仪的一臂与置有一定量西柚果肉和果皮混合物的味源瓶相连作为处理, 另一端与空白味源瓶相连作为对照测试时空气流量为 200mL/min从 Y 型嗅觉仪基管末端引入 20 头供试桔小实蝇雌虫每次测试 10min, 测试结束后进入某一测试臂成虫视为对该侧气味源有选择性, 停留在基臂的成虫视为未发生反应分别记录进入两侧臂的桔小实蝇数目利用上述方法, 分别测定桔小实蝇雌虫对不同剂量 (1、10 和 40g) 西柚 (果肉和果皮混合物) 的反应每个处理10 次重复, 每次测试后调换 Y 型管两臂方向, 以消除几何位置对桔小实蝇行为的影响每作完一个处理, 立即用 95% (体积分数) 乙醇清洗整个装置, 并于100℃烘箱中烘干备用1.3.2 西柚挥发物的采集选取成熟、健康的西柚果, 洗净, 晾干表面水分, 称取约 40g 果肉和果皮混合物, 将其密封于 200mL 的顶空样品瓶中进行气味平衡 15min, 然后采用 75μm CAR/PDMS 进行顶空萃取 30min, 再于 250℃解吸 3min 进样。
1.3.3 西柚挥发物的 GC-MS 测定色谱条件:DB-5 石英毛细管柱 (柱长 30 m, 内径 0.25 mm, 膜厚 0.25μm) ;载气为氦, 进样口温度 220℃, 流速 1mL/min, 分流比为 1∶20柱温采用程序升温, 初始温度 50℃, 保留 5min, 然后以 5℃/min 升温速度升至 180℃, 保持2min, 再以 10℃/min 升温速度升至 220℃, 保留 5min质谱条件:接口温度 250℃, 电离方式 EI, 电子能量 70eV, 检测器电压 350V, 扫描质量范围 35~335u采用相应质谱图计算机检索方法进行检索确定挥发物成分, 并采用面积归一法计算相对含量1.4 数据处理与分析数据采用 Microsoft Excel 2007 进行处理, 采用 SPSS 22 软件进行差异显著性分析2 结果与分析2.1 西柚气味对桔小实蝇选择行为的影响试验结果看出, 当西柚测试剂量为 1g 时, 桔小实蝇雌虫对西柚和空白对照的选择率分别为 9.6%和 9.2%, 两者无差异显著 (p>0.05) ;当西柚测试剂量为 10g时, 桔小实蝇雌虫对西柚和空白对照的选择率分别为 12.2%和 6.1%, 两者差异显著 (p<0.05) ;当西柚测试剂量为 40g 时, 桔小实蝇雌虫对西柚和空白对照的选择率分别为 16.1%和 2.5%, 差异显著 (p<0.05) 。
雌虫对西柚的选择率随西柚测试剂量增加而增加2.2 西柚气味的化学成分测定结果看出, 从西柚气味 (挥发物) 中共检出 11 种相对含量大于 0.1%的化合物 (在挥发物总量中占 53.54%) 其中, 主要物质为 (+) -柠檬烯 (45.52%) 、月桂烯 (4.09%) 、 (1R) - (+) -α 蒎烯 (1.28%) 、β-石竹烯 (0.64%) 和萜品油烯 (0.61%) 等 5 种烯类物质, 相对含量均大于 0.5% (见表 1) 表 1 西柚成熟果挥发性化学物质及相对含量 (GC-MS) 下载原表 3 小结与讨论植物挥发物在植食性昆虫的寄主选择中发挥着关键作用许多水果挥发物对桔小实蝇有明显的引诱作用[12-14]本试验表明, 在室内条件下, 成熟西柚果实对桔小实蝇雌虫具有显著的引诱效果有文献报道, 萜品烯和 β-石竹烯等物质对性成熟桔小实蝇雌虫具有显著的引诱效果[15], β-石竹烯对棉铃虫Helicoverpa armigera 的产卵有显著的引诱作用[16], 思茅松针叶中所含的α-蒎烯和柠檬烯和对松实小卷蛾 Petrova cristata 雌蛾的产卵具有刺激作用[17], 柠檬烯对马铃薯块茎蛾 Phthorimaea operculella 雌虫和绿盲蝽Apolygus lucorum 雄虫具有吸引作用[18-19], 喜马拉雅落叶松 Larisx potaninii var.macrocarpa 球果所含的月桂烯对丽江球果花蝇 Strobilomyia lijiangensis 具有引诱作用[20], 华山松树枝梢挥发物中含量较高的月桂烯和柠檬烯可引起营养补充期华山松木蠹象 Pissodes punctatus 较大的室内趋向反应[21], 月桂烯对松果梢斑螟 Dioryctria pryeri 雌成虫和棉铃虫的产卵具有显著引诱作用[22-23]。
本试验从西柚挥发物中初步鉴定出 11 种相对含量大于0.1%的化学成分, 其中, 相对含量大于 0.5%的化合物为 (+) -柠檬烯、月桂烯、(1R) - (+) -α 蒎烯、β-石竹烯和萜品油烯等 5 种化合物, 且已有文献报道这些化合物对多种害虫的产卵有明显的引诱作用因此, 推测这 5 种化合物可能是西柚引诱桔小实蝇雌虫的主要活性物质这几种化合物单体或混合物对桔小实蝇雌虫的引诱活性尚在研究中, 若能确定这些化合物对桔小实蝇具有活性, 则将有助于推动桔小实蝇雌虫引诱剂的开发参考文献[1]ALYOKHIN A V, MILLE C, MESSING R H, et al.Selection of pupation habitats by oriental fruit flylarvae in the laboratory[J].Journal of insect behavior, 2001, 14 (1) :57-68 [2]潘志萍, 李敦松, 黄少华.球孢白僵菌对桔小实蝇致病力的测定[J].华中农业大学学报 (自然科学版) , 2006, 25 (5) :518-519 [3]NAKAKARA S, KOBASHIGAWA Y, MURAJI M.Genetic variations among and within populations of the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Diptera;Tephritidae) , detected by PCR-RFLP of the mitochondrial control region[J].Journal of applied entomology and zoology, 2008, 43 (3) :457-465 [4]HSU J C, FENG H T.Insecticide susceptibility of the oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis (Hendel) ) (Diptera:Tephritidae) in Taiwan[J].Chinese Journal of Entomology, 2000, 20 (2) :109-118 [5]章玉苹, 曾玲, 陆永跃, 等.华南地区桔小实蝇抗药性动态监测[J].华南农业大学学报 (自然科学版) , 2007, 28 (3) :20-23 [6]STEVEN H R, DANA B B.Use of biomonitoring data to evaluate methyl eugenol exposure[J].Environmental Health Perspectives, 2006, 114 (11) :1797-1801 [7]马艳粉, 田先娇, 胥勇, 等.几种物质对火龙果园内桔小实蝇的诱集效果[J].中国南方果树, 2017, 46 (2) :116-118 [8]ALUJA M, MANGAN R L.Fruit fly (Diptera:Tephritidae) host status determination:Critical conceptual and methodological considerations[J].Annual Review of 。