第五章 单克隆抗体Monoclonal AntibodiesMonoclonal Antibodies一、相关免疫学基础及问题的引出免疫系统（immune system）是机体执行 免疫应答及免疫功能的 一个重要系统由免疫 器官、免疫组织、免疫 细胞和免疫分子组成 是防卫病原体入侵最有 效的武器，它能发现并 清除异物、外来病原微 生物等引起内环境波动 的因素但其功能的亢 进会对自身器官或组织 产生伤害骨髓骨髓造血干细胞B细胞在骨髓微环境中，HSC首先分化为髓样 前体细胞和淋巴样前体细胞髓样前体 细胞最终分化为粒细胞、单核细胞、红 细胞、血小板；淋巴样前体细胞分化为T 淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞骨髓中产生的淋巴样前体细胞循不同的途径分 化发育，其中一部分在骨髓内发生抗原受体 （BCR）等表面标志物的表达、选择性发育或 凋亡等最终分化为成熟的B细胞B细胞进入 血液循环，定居在外周免疫器官抗体是B细胞接受抗原刺激后增殖、分化为浆细胞， 产生的糖蛋白，是介导体液免疫的重要效应分 子免疫球蛋白的生物学活性1）与相应抗原特异性结合2）激活补体3）结合细胞，产生多种生物学效应4）通过胎盘被动免疫二、 人工制备抗体（一） 多克隆抗体（二） 单克隆抗体1 单克隆抗体技术2 人源单克隆抗体（三） 基因工程抗体（四）单克隆抗体的应用一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定簇的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。
一） 多克隆抗体一群B淋 巴细胞b ac抗原bac抗原a决定簇相应抗体（单克隆）b决定簇相应抗体（单克隆）c决定簇相应抗体（单克隆）针对同一抗原的多个单克隆抗体混合在一起叫多克隆抗体ac抗原ac抗原bb• 多克隆抗体的制备过程• 多克隆抗体的用途：中和抗原、免疫调理、介导ADCC等• 多克隆抗体的局限性：特异性不高、易发生交叉反应、不易大量制备动物脾脏和淋巴结内有上百万个B淋巴 细 胞，每个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的 一个抗原决定簇产生的抗体是单克隆抗体二）单克隆抗体•单克隆抗体：利用细胞融合技术，将能够产生抗体的B淋巴细胞（antigen stimulated B lymphoblast)和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞(myeloma)融合在一起，形成杂交瘤细胞(hybridoma cell)杂交瘤细胞既能在体外无限增殖，又能持续分泌成分单一的特异性抗体这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体1、单克隆抗体技术（1） 融合亲本细胞的选择（2） 融合细胞的制备（3） 杂交瘤细胞的的筛选（4） 分泌目标抗体的杂交瘤细胞的筛选（5）单克隆抗体的大量生产技术流程（1） 融合亲本细胞的选择 B细胞最佳来源：高度免疫个体的激活淋巴细胞。
采用与骨髓瘤 细胞供体来源同一品系的动物进行免疫① 抗体生成细胞（B细胞）动物免疫：动物免疫：目的：目的：在细胞融合后获在细胞融合后获 得尽可能多的分得尽可能多的分 泌针对于该目标泌针对于该目标 抗原的特异性抗抗原的特异性抗 体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞. .特定特定目标抗原目标抗原免疫免疫动物动物刺激刺激淋巴结、脾脏中淋巴结、脾脏中B B淋巴细胞淋巴细胞B B淋巴细胞淋巴细胞大量增殖大量增殖能分泌针对于该抗能分泌针对于该抗 原的原的特异性抗体特异性抗体一般要经过初次免疫、第二次免疫、加强免疫（向动 物静脉内注射抗原）三个过程当选定动物品系和抗原后，应仔细设计 免疫方案，应 考虑如下问题：• 抗原的性状• 免疫途径• 免疫次数• 再次免疫间隔时间• 是否使用佐剂• 使用何种佐剂• 动物对抗原的免疫应答状况检测• 颗粒性抗原有较强的抗原性，免疫时不加佐剂可溶 性抗原需添加适量的佐剂，增强免疫效果• 可溶性抗原可经过化学修饰或将其固定在载体上使之成为颗粒性抗原•半抗原需与蛋白或其它载体共价连接后再开始免疫• 细胞作为免疫原时，应对细胞尽量洗涤，以除去培养 液中的外源性蛋白，如牛血清蛋白。
不同类型抗原的免疫方式：脾细胞制备、分离在末次免疫后3-5d左右即可取脾脏分离淋巴细胞收集过程要严格无菌脱颈处死小鼠，依次用2.5%碘酊和75%酒精进行皮肤消毒，打开腹腔，小心取出脾脏，注入0.5ml无血清培养基使脾脏轻度肿胀，用小号针头多点刺破脾脏被膜，轻轻挤压使淋巴细胞逸出需要的话可用抗原再做一下富集②骨髓瘤细胞 • 骨髓瘤细胞的诱导：• 一些品系的小鼠经腹腔注射矿物油可诱生出骨髓瘤• 用8-杂氮鸟嘌呤（8-Az）或6-巯基嘌呤（6-TG）来筛选HGPRT- (次黄嘌呤鸟嘌呤磷酰核糖转移酶)突 变体• 用 Br-脱氧嘧啶核苷来筛选TK-(胸腺嘧啶核苷激酶)突 变体• 筛选机理：由于HGPRT或TK在利用补救途径合成DNA时可将这 些碱基类似物掺入DNA而导致细胞死亡逐步提高这些药 浓度，使HGPRT+或TK+细胞全部死亡，而HGPRT-或TK-因 不会掺入这些碱基类似物而存活下来l 骨髓瘤细胞制备的注意事项l 用作杂交瘤亲本的骨髓瘤细胞本身不分泌任何抗体或免疫球蛋白 ，否则将可能影响单克隆抗体产生l 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高l 对融合效率高的亲本骨髓瘤细胞应及时扩增，冻存。
一般在准备 融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞l 保证骨髓瘤细胞处于对数生长期在培养过程中可加入8-AZ或6- TG以防HGPRT酶缺失回复突变2）融合细胞制备• 培养基：DMEM(多用于小鼠细胞融合)RPMI1640(制备人单克隆抗体)• 血清：预实验筛选能够促进克隆细胞生长或使融合细胞迅速增殖的血清制备单克隆 抗体以胎牛血清为好或使用无血清培养基• 抗生素：青霉素、链霉素、庆大霉素、卡纳霉素、两性霉素B以及制霉菌素动物细胞融合的几种方法？将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2：1或10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心7—10分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻地振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG 0.5 ml，随后静置90秒，再于5分钟内边振摇边逐滴加入5－10ml不含血清的培养液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，之后静置10分钟洗涤后，培养筛选融合细胞PEG 融合举例---------培养基的选择培养基中有三种关键成分：n次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、n氨基蝶呤（aminopterin，A）n胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）n所以取三者的字头称为HAT培养基。
3）融合细胞的筛选①基于细细胞瘤突变变株的HAT培养基的筛选筛选 法---------亲本细胞的特性骨髓瘤细胞myeloma：一般不分泌抗体，能在 体外无限繁殖和连续继代培养，且为HGPRT－ （次黄嘌呤鸟嘌呤磷酰核糖转移酶）或TK－ （胸腺嘧啶核苷激酶）多用BALB/C 小鼠的 骨髓瘤细胞淋巴细胞lymphocytes：经过免疫处理的淋巴 细胞，多用大鼠或小鼠融合后的各种类型细胞的命运• 融合的B细胞和瘤细胞：由于杂交细胞获得了（1）B细胞的HGPRTHGPRT、、 TK TK 酶基因 并正常表达、利用培养基中的H、T 合成DNA（2）瘤细 胞的“永生性”而得以存活和无限扩增• 未融合的B细胞、融合的B细胞和B细胞以及B细胞的多聚 体：虽然有HGPRTHGPRT、、 TK TK 酶基因并正常表达，但是逃脱不了 有限存活的命运正常的B细胞在培养基中存活仅 5～ 7天• 未融合的瘤细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、以及瘤细胞 的多聚体等：因不能正常合成DNA而死亡② 杂氮丝氨酸取代氨基喋呤的作用③ 腺嘌呤（A）取代次黄嘌呤（H）构成AAT培养基（4）分泌目标抗体的杂交瘤细胞的筛选必要性：通过选择性培养而获得的杂交瘤细胞系中，仅少 数能分泌针对免疫原的特异性抗体。
方法： l ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等单克隆抗体（ McAb）的检测 l 放射免疫法 （RIA）用于可溶性抗原、细胞McAb的检测 l FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测 l 间接免疫萤光法 （IFA）用于细胞和病毒McAb的检测 l 上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实 验过程 （5） 单克隆抗体的大量生产①实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞按接种于小鼠背部皮下待肿瘤达到一 定 大小后(一般10～20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含 量可达到1-10mg／ml采血量有限②腹水制备法腹腔注射杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，处死小 鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水 可反复收集数次腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml， 这是目前最常用的方法③体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆 抗 体但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ ml如 果大量生产，费用较高 ④ 生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗2，人源性单克隆抗体制备 问题的提出：鼠源性单抗的局限性。
•引起人抗鼠反应 •抗体很快被机体清除 •产生过敏反应、不能有效激发机体免疫防御系统目标：获得低免疫原性、高效性、人源性单克隆抗体困难：缺乏像小鼠骨髓瘤那样的融合效率高、性状稳定的融合亲本细胞系，不能用任 意抗原免疫人体获得足够数量的抗原特异性B细胞① EBV制备无支原体污染的B95-8（EBV转化的绒猴白细胞 ）在诱导剂（如正丁酸）的作用下制备病毒培养2-3d后，收集上清，0.4μm孔径滤膜过滤，获得病毒，液氮冻存备用② 制备用于转化的B淋巴细胞用淋巴结、扁桃体、脐带血、外周血，泛影葡胺-聚蔗糖密度梯度离心分离人B淋巴细胞，离心沉淀细胞1）EB病毒转化制备人源单克隆抗体技术③ 转化加入新配置的病毒液（含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液与病毒过滤液1:1混合），调整细胞浓度107个细胞/ml,温浴2-3h,弃上清，加入含20%血清的RPMI-1640培养液，接种于96孔板 中，每孔接种量0.1-0.5个细胞/ml,每3-5d换液一次约一周左右即可见到转化的细胞④ 传代、冻存、监测一些淋巴母细胞也能释放病毒，当这些淋巴母细胞与淋巴细胞共养 时，也能诱导出分泌抗体的转化细胞⑤实际操作中影响EBV对细胞转化的影响因素及注意 事项：• 支原体污染，导致转化效率低• 血清中抗体阳性者体内存在对病毒特异性记忆细胞，机体会产生对EBV的免疫反应，特别是细胞免疫反应，因此应采用抗体阴性个体的B淋巴细胞或将T细胞除去。
• 转化后，细胞明显增殖时应及时传代，并检测上清免疫球蛋白和抗体分泌情况• EBV转化B细胞克隆效率低，提高克隆成功率十分困难转化细胞抗体分泌能力不稳定2）细胞工程单克隆抗体技术①人鼠杂交瘤单克隆抗体• 基本方法与鼠-鼠杂交相同• Nowinski(1980)报道在体外用流感病毒致敏人脾细胞,再与NS-1(小鼠骨髓瘤细胞)细胞融合，成功地得到了针对Forssman抗原 (嗜异性抗原 )的人单克隆 抗体• 人-鼠杂交瘤的人单克隆抗体分泌性很不稳定可能是由于人染色体丢失或信号传递缺乏相关② 人-人杂交瘤单克隆抗体• 人-人杂交瘤单克隆抗体核型稳定• 但可供利用的人类骨髓瘤细胞种类非常有限加上人B淋巴母细胞系和淋巴瘤细胞共有三十几株目前实验室仍较多使用由EBV转化的B细胞筛选出来的淋巴母细胞系• 人类骨髓瘤细胞和淋巴瘤细胞种类很少，实际 应用中，融合率低，形成的杂交瘤分泌抗体 少，远不及制备鼠单抗的融合亲本骨髓瘤细胞相比③EBV转化-融合技术EBV转化后的B淋巴细胞与鼠源骨髓瘤细胞融 合，产生一系列人鼠杂家瘤细胞系（series of human-mousehybridyzation,SHM）。