电子自旋共振法（ESR） 、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机 体的损伤目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·） 、羟基自由基体系（·OH） 、 二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进 行了研究其中 ESR 法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设 备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及而其中的分光光度法、化学 发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定 过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响分光光度法 最常用原理部分：1.DPPH·法测试机理DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸 收峰为 492nm当自由基清除剂加入到 DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被 配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度 与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被 消除的情况2. 羟基自由基（·OH） 1）邻二氮菲法[70] 实验原理：邻二氮菲可与 Fe2+形成络合物，此络合物在 510nm 处有最大 吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原 状态的改变。
H2O2/ Fe2+体系可通过 Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲 －Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其 510nm 最大吸收峰消 失如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则 Fenton 反应产生的羟自由 基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之 减少根据这一原理，可建立以 A510 变化反映自由基清除剂对羟自由基清除 作用的比色测定法 2）水杨酸法[71] 实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸 捕集 Fenton 反应体系中的·OH，生成的 2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨 酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在 510nm 处的吸光值，此吸 光值可反映体系中的羟自由基浓度 3）甲基紫-Fe2+-H2O2 反应体系 测定原理：在 Fenton 反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下：Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH甲基紫在酸性溶液中呈现紫色[9],在 578nm 处有强吸收反应产生 的·OH 具有高的反应活性，容易进攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高 电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。
通过测定甲基紫在 578nm 处吸光度值的变化可间接测定出·OH 的生成量当有清除自由基的物 质存在时，会阻断甲基紫与·OH 的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重， 因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱3.超氧阴离子自由基（O2-·） 邻苯三酚法： 超氧自由基难于用一般方法产生和检测,但是在弱碱性条件下, 邻苯三酚能 发生自氧化反应,生成 O2-·和有色中间产物, 该中间产物在 λ=320 nm 处有一 特征吸收峰在初始阶段, 中间产物的量与时间成线性关系当加入 O2-·清除 剂时, 它能迅速与 O2-·反应, 从而阻止中间产物的积累, 致使溶液在 λ =320 nm 处吸收减弱故可以通过测定 A320 值来评价清除剂对 O2-·的清除作用1. 黄儒强，李娘辉，黄科礼，郑陆威，林盛，林健华.(华南师范大学生命科学 学院，广东 广州 510631) 山稔子黄酮类提取物抗自由基作用及体内抗氧化功 能的研究[J].食品科学，2008,29（9）：588-590. 1.3.2 动物试验方法 选用雄性昆明种小鼠，适应性饲养 1 周后，随机分为 4 组，每组 10 只， 分别为正常对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。
低、中、高剂量组小鼠 每天灌胃 1 次，每次 0.5ml 对试验小鼠重新进行分组，分为高剂量组、中剂量组、低剂量组和对照组 各组均常规饲养，自然光照，自由饮水除对照组外，其他各组进行如下处理： 每天给药 1 次，每次每只灌胃 0.5ml 1.3.3 动物实验指标测定及统计分析 连续试验 3 周，最后一次给药后，禁食 2h，摘取各小鼠眼球取血，离心分 离，吸取上层血清，用于 SOD、GSH-Px、MDA 的测定以对照组为对照，对 各试验组数据用 SPSS11.0 作单因素方差分析和均数间多重比较 1.3.4 清除羟自由基[7] 取 6 支 10ml 比色管，分别依次加入 0.3ml7.5mmol/L 硫酸亚铁铵溶液、 0.3ml7.5mmol/L 邻二氮菲溶液、1mlpH7.47Tris-HCl 缓冲溶液，在 2、3、4、5、6 号比色管中各加入 0.2ml7.5mmol/LH2O2，然后在 3、4、5、6 号比色管中分别加入 0.3ml 浓度分别为 0.02、0.04、0.08、0.10mg/ml 的山稔子 黄酮类提取物，用重蒸水定容至刻度，在 37℃的水浴中，反应 1h，在 450～550nm 波长范围内扫描，得最大吸收波长，并在此波长下测光密度值，根 据下式计算羟自由基的清除率：式中，OD样品、OD未损及 OD损，分别为加入提取液的羟自由基体系、不 加 H2O2 及加入 H2O2 的光密度值。
1.3.5 对超氧离子自由基(O2·)的抑制率 取 4 支 10ml 的比色管，各加入 2.0ml pH8.34 Tris-HCl 缓冲溶液，依次分 别加入 1.0ml 浓度分别为 0.02、0.04、0.08、0.10mg/ml 的山稔子黄酮类提取物，最后都加入 1.0ml 0.2mmol/L 邻苯三酚，重蒸水定容至刻度在吸收波长 322nm 处每隔 30s 记录一次光密度值,根据邻苯三酚自氧化速率计算抑制率：式中，ΔOD1/Δt 为邻苯三酚自氧化时反应速率，ΔOD2/Δt 为加入提取 液后邻苯三酚自氧化反应速率2. 陈旭丹,于晓莹,郝晓萌,陆曦,王威.(天津师范大学化学与生命科学学院, 天津 300074) 三种黄酮类化合物抗自由基的研究[J]. 食品研究与开发 2007,128（6）：20-22. 连苯三酚法和 DPPH 法对其清除活性自由基的能力进行研究 1.2.2 连苯三酚法 1.2.2.2 清除超氧自由基的测定步骤 分别将金银花和葛根的提取液配制成百分浓度为 20 %、30 %、40 %和 10 %、20%、30%的待测液用 10mmol/L HCl 溶液配制成 1.5 mmol/L 的连苯三 酚溶液; Tris- HCl 缓冲溶液为 50 mmol/L, pH 值为 8.2; 各样品浓度为 1 mmol/L。
按表 1 加样于具塞比色管中, 迅速摇均后每隔 30 s,以 10 mmol/L HCl 溶液为参比液,光程 1 cm,用紫外-可见分光光度计于 320 nm 处测定相应吸光度 值, 至 3 min 止取 3 次试验的平均值计算清除率清除率计算公式: S=[1-(Aj-Ai)/A0]×100 % S:清除率; Ai:待测液在 320 nm 的吸光值; Aj:待测液与连苯三酚混合物的吸 光值; A0:连苯三酚在 320 nm 的吸光值 1.2.3 DPPH 法 1.2.3.1 原理 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 或 1,1-二苯基苦基苯肼)分子结构图,见 图在有机溶剂中是一种稳定的自由基, 其乙醇溶液(显深紫色)在 517nm 处有 最大吸收峰,见图当与抗自由基活性物质作用时, 其孤对电子被配对, 因而吸 收消失或减弱,通过测定吸收减弱的程度,可评价自由基清除剂的活性1.2.3.2 清除自由基的测定步骤 分别将金银花、葛根和栗子叶的提取液配制成百分浓度为 10 %、20 %、30 %、40 %、50 %的待测液DPPH 用 70 %的乙醇配制成 6.5×10-5mol/L 的溶液; 按表 2 加样于具塞比色管中, 摇匀反应 30 min 后, 用紫外-可见分光 光度计, 光程 1cm, 70%乙醇溶液为参比液, 在 517 nm 处分别测定吸光度值 A0、 Ai、 Aj。
按下列公式计算清除率: S ( %) =[1- ( Ai- Aj ) /A0]× 100 % S:清除率; Aj:待测液在 517 nm 的吸光值; Ai: 加入 DPPH 待测液后的吸光值;A0:DPPH 在 517nm 的吸光值3.牛骨胶原多肽的制备及其清除自由基活性研究（华南理工大学硕士研究 生论文） 4.3.2 水解物清除超氧阴离子（O2-·）能力的测定 本实验采用邻苯三酚自氧化法[89]测定样品清除超氧阴离子的活性 取浓度为 80g/L 的水解样品溶液 0.2mL，加入 pH8.2，50mmol/L 的 Tris- HCl 缓冲液 4.5mL，蒸馏水 4mL，混匀，置于 27℃保温 10min，作为试剂 A；取 0.3mL 3mmol/L 的邻苯三酚溶液，置于 25℃下保温 10min，作为试剂 B；以试剂 A 与 0.3mL 10mmol/L HCl 溶液的混合液作为空白调零后，将试剂 A 与试剂 B 迅速混合，在 320nm 处测定 3min 内吸光度的变化，回归求出吸 光度变化斜率 K1 以蒸馏水代替水解样品溶液作为对照样品重复上述过程，得出吸光度变化 的斜率为 K0； 计算清除超氧阴离子的能力：式中：K0——空白对照液的吸光度变化斜率K1——加入水解液后的吸光度变化斜率4.3.3 水解物清除羟基自由基（·OH）能力的测定 采用水杨酸法测定水解物清除羟基自由基（·OH）能力[90]。
在反应体系中加入 10mL 9mmol/L FeSO4 溶液和 10mL 9mmol/L 的水杨酸 -乙醇溶液，然后加入浓度为 80g/L 的水解样品溶液 10mL，最后加入 10mL 8.8mmol/LH2O2 启动反应对照液中以 10mL 蒸馏水替换同体积的水解液，37℃条件下保温 0.5h以蒸馏水为参比液，在 510nm 测定其吸光值计算清除羟基自由基的能力：式中：A0——空白对照液的吸光值Ax——加入水解液后的吸光值Ax0——水解液的本底吸光值4.3.4 水解物清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）能力的测定[91] 二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）法是一种广泛用于筛选抗氧化剂的方 法，用该法测定了水解物清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的能力 将 2mL 浓度为 80g/L 的水解液与 2mL 0.1mmol/L 的 DPPH·-乙醇溶液混 匀置于试管中,静置 30min 后，以无水乙醇作为参比测定其吸光度 Ax；在对照 液中，以 2mL 无水乙醇代替水解液，静置 30min 后，以无水乙醇作为参比测定其吸光值 A0；取相同浓度的水解液 2mL 和 2mL 的无水乙醇混匀，以无水乙醇 作为参比测定其本底吸光值 Ax0。
计算清除二苯代苦味酰基自由基的能力：式中：A0——空白对照液的吸光值Ax——加入水解液后的吸光值Ax0——水解液的本底吸光值4.白腐菌降解木质纤维素过程中清除自由基物质产生研究（华中科技大学 硕士学位论文） 2.2.5 羟自由基清除率测定 （1）邻二氮菲法[70] 实验原理：邻二氮菲可与 Fe2+形成络合物，此络合物在 510nm 处有最大 吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原 状态的改变H2O2/ Fe2+体系可通过 Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲 －Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其 510nm 最大吸收峰消 失如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则 Fenton 反应产生的羟自由 基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之 减少根据这一原理，可建立以 A510 变化反映自由基清除剂对羟自由基清除。