1博莱霉素损伤早期 EGF，TGF┐β1 活性表达与肺泡泡炎病理分级作者：王玮魏经国魏龙晓崔光彬陆洲张伟李琦【关键词】肺纤维化关键词:肺纤维化;表皮生长因子-尿抑胃素;转化生成因子-β;病理学摘要:目的定量测量小鼠肺泡炎肺泡灌洗液中 EGF，TGF-β1 的表达与同期肺泡炎的病理分级和肺泡Ⅱ型细胞超微结构的变化间的关系.方法通过气管内滴注博莱霉素 A5 建立小鼠肺泡炎模型，按采集灌洗液的时间（1，3，7d）分为 3 组，分批直视下取肺泡灌洗液，采用夹心 ELISA 法定量检测灌洗液中 EGF，TGF-β1表达，同时取各组的肺组织行常规 HE 染色，光镜观察肺泡的病理变化及炎症分级，电镜观察肺泡Ⅱ型细胞的超微结构变化.结果实验组 ELISA 测定显示:1，3，7d 组肺泡灌洗液中 EGF 的水平均低于正常对照组（P<0.01） ，TGF-β1的水平有所升高，但与正常对照组比较无显著性差异.病理学检查显示，各组病变以Ⅰ级肺泡炎为主，随病程进展逐渐向Ⅱ，Ⅲ级发展，肺泡Ⅱ型细胞变性坏死以 3，7d 组明显.将 EGF 和 TGF-β1 的水平与肺泡炎的分级对照相比较，各组EGF 水平变化与肺泡炎分级相关不显著，但 r 值均为负值.TGF-β1 水平升高与肺泡炎分级呈显著正相关（P<0.01）.结论博莱霉素损伤早期肺泡Ⅱ型细胞变性、坏死，抑制了 EGF 自分泌的机制，诱导 TGF-β1 活性高表达是肺间质纤维化进程启动的重要因素之一.Keywords:pulmonaryfibrosis;epidermalgrowthfactor-uro-gastrone;transforminggrowthfactorbeta;pathologyAbstract:AIMQuantitativemeasurementofEGF，TGF-β1inthealveolarlavagefrompulmonaryalveolitis（PAL）ofthemousemAelandcomparativeanalysisofpathologicalgradingofsimultaneouspulmonaryalveolitiswiththeultrastructurechangesofalveolartypeIIcell.METHODSPALmousemAelswereestablishedbysingleintratrachealinjectionofbleomycinA5（BLMA5）.After1，3，7d，mousemAelswereoperatedonaccordingtothedividedgroupsandBALwasobtained.EGFandTGF-β1quantitativeexpressionofBALwasstudiedbyadoptingELISAmethA.ThepulmonarytissueswereobtainedandthepathologicalchangewasdemonstratedunderroutinemicroscopeandtheultrastructurechangesofalveolartypeIIcellwereobservedthroughanelectronicmicroscope.RESULTSELISAmeasurementoftheexperimentalgroupsshowedthatEGFexpressionsofBALof1，3and7dgroupswerelowerthanthoseofnormalgroups（P<0.01） ，buttheTGF-β1expressionsincreasedwhiletheydidnotmakeanydistinctdifferenceincontrastwiththenormalgroups.PathologicalexaminationdiscoveredthattheI-2ratePALtookadominantpositionandwiththede-velopmentofthecourseitworsenedintotheⅡandⅢ-ratePALgradually.Theelectronicmicroscopecheck-upshowedthatthealveolartypeⅡcellintheexperimentalgroupsend-edupinbothdegenerationandnecrosiswiththemoststrik-ingdistinctionin3，7dgroups.ThecomparativeanalysisofEGFandTGF-β1expressionwiththegradingofPALshowedthatthechangesofEGFexpressionineachgroupwerenotclearlyrelatedwiththegradingofPAL，butr-valueprovednegative.TheincreaseofTGF-β1expressionhadcloseassoci-ationwiththegradingofPAL（P<0.01）.CONCLUSIONDegenerationandnecrosisofthealveolartypeⅡcellofpul-monaryalveolitisinearlyBleomycin-inducedpulmonaryin-juriesmayinhibittheautocrineofEGFwhiletheyinducetheactivehighexpressionofTGF-β1，whichmightbeoneofthemajorfactorsintheinitiationofpulmonaryinterstitialfibro-sis.0 引言博莱霉素 A5（BLMA5）复制的小鼠肺间质纤维化动物模型与人类的病变类似［1］ ，已广泛应用于该病的研究.近年研究显示，在肺间质纤维化形成过程中，某些细胞因子可能起重要作用.其中表皮生长因子（epidermalgrowthfactor，EGF）和转化生长因子-β1（transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）是人们关注的热点［2，3］.但这两种细胞因子与肺泡炎病理变化的对照研究以及肺泡Ⅱ型上皮细胞的形态学变化间的关系国内外未见相关报道.本研究采用 BLMA5 气管内滴注所致小鼠肺间质纤维化模型，对肺泡灌洗液中这两种细胞因子进行分析并与同期实验组小鼠肺组织的病理改变进行对照研究.1 材料和方法1.1 材料 TGF-β1，EGF，ELISA 试剂盒购自深圳晶美工程有限公司，选用96T，TGF-β1，批号:011027GEGF 批号:011112ABLMA5:日本株式会社生产，15mg/支，批号:910608.实验动物:本校实验动物中心提供健康雄性昆明小鼠 51只，体质量 80～100g.1.2 方法1.2.1 肺纤维化动物模型制备雄性昆明小鼠 51 只，分 1，3 及 7d3 组，每组17 只，每组模型制作 12 只，正常对照 5 只.BLMA5 气管插管给药，用量为2.5mgkg-1，用 9gL-1 生理盐水配成 4gL-1 的溶液，采用氯胺酮 ip 麻醉，用量为 0.3mLkg-1.采用细聚乙烯塑料管与注射器相连，BLMA5 药液预先装在注射器内，插管达气管分叉处，缓缓注入 BLMA5.注完药后将动物直立、旋转，使药液在肺内均匀分布.数分钟后，动物恢复常态，正常进食饮水.实验组模型复制成功各组 8 只，共 24 只.31.2.2 肺泡灌洗液采集于注药后 1，3，7d 各组动物在氯胺酮腹腔注射麻醉后，开胸直视下行肺泡灌洗.灌洗液为 9mLL-1 生理盐水，每次用量约0.3mL，共灌洗 3 次.第 1 次弃之，混合第 2、3 次灌洗液共约 0.4mL，用于 ELISA分析.取左肺组织 40gL-1 甲醛溶液内浸泡固定后，经石蜡包埋、5μm切片，HE 染色，备以光镜病理学检查.取右肺切取 1mm3 大小的组织块投入预先配制好的前固定液中（前固定液①10mgml-1 钌红;②0.3molL-1 二甲胂酸钠缓冲液;③180mLL-1 戊二酸;④180mLL-1 单宁酸.使用前按 2∶2∶1∶1 比例配制）密封后置 4℃冰箱中固定 12h.然后用0.1molL-1 二甲胂酸钠缓冲液冲洗三次共 30min 后，置于配制好的后固定液中（后固定液:50mLL-1 锇酸和前固定液中的①、②液按 1∶1∶1配制）.固定 15min 后逐级用丙酮脱水、环氧丙烷媒浸、环氧树脂包埋、薄片定位，切成超薄片，醋酸钠和椽酸铅染色，JEM-2000EX 型透射电镜观察.1.2.3TGF-β1，EGF 含量测定采用双抗体夹心 ELISA 法，抗人 TGF-β1 和EGF（同源性 TGF-β198%，EGF70%）单抗被包被于酶标板上，灌洗液中和标准品中经活化的 TGF-β1 和 EGF 与各自单抗结合，未结合物将被洗去，加入辣根过氧化物酶标记的抗人 TGF-β1，EGF，与结合在单抗上的 TGF-β1，EGF 结合而形成免疫复合物，洗去复合抗体，加入显色剂，若反应孔中有上述两种细胞因子，将有蓝色出现，加终止液变黄.在 450nm 处测 A 值，细胞因子浓度与 A450nm 值之间呈正比，通过绘制标准曲线求出标本液中 TGF-β1 和 EGF 浓度.1.2.4 组织病理观察光镜观察，参照 Szapiel 等［4］的方法确定肺泡炎的程度，将肺泡炎分为 4 级:（0）无肺泡炎;（1）轻度肺泡炎（Ⅰ级）表现为单核细胞浸润使肺泡膈增宽，仅限于局部和近胸膜部，面积小于全肺的 20%，肺泡结构正常;（2）中度肺泡炎（Ⅱ级） ，受累面积占全肺的 20%～50%，近胸膜部较重;（3）重度肺泡炎（Ⅲ级） ，面积大于 50%，偶见肺泡腔内有单核细胞及出血造成的实变.电镜观察:肺泡上皮基底膜的完整性;肺泡Ⅱ型上皮细胞的超微结构.重点观察胞质内板层小体的数量与形态，同时观察线粒体、高尔基体及粗面内质网的结构变化.2 结果2.1 各组肺泡灌洗液细胞因子浓度2.1.1 肺泡灌洗液 EGF 浓度肺泡灌洗液 EGF 浓度 ELISA 测定结显示，1，3，7d 实验组肺泡灌洗液中 EGF 含量平均值显著均低于同期对照组（P<0.05 或 P<0.01） ，且随病程延长有下降趋势，1d 和 3d 实验组 EGFA值间 t=2.083，P<0.05.1d 和 7d 实验组 EGFA 值间 t=3，P<0.01.对照组肺泡灌洗液中 EGF 浓度无明显变化（Fig1）.图 1 略2.1.2 肺泡灌洗液中 TGF-β1 浓度肺泡灌洗液中 TGF-β1 浓度 ELISA 测定结果显示，7d 实验组与对照组 TGF-β1 浓度近似，1d 及 3d 实验组 TGF-β1 浓度均4稍高于对照组，但实验组 TGF-β1 水平有下降趋势.各对照组肺泡灌洗液 TGF-β1 水平无明显变化.图 2 略2.1.3 各组 EGF，TGF-β1 阳性率实验组 1，3，7d 各组均为 8 只小鼠，因 7d组一只小鼠取材时肺出血严重故未做肺泡灌洗，因此该组实际纳入统计动物为 7只共计 23 只小鼠.Tab2 实验组与之相同.Tab1 结果:实验组中 EGF 阳性率为 21%，正常组 66%，两组 χ2 检验P<0.01，差异有高度显著性.显示实验组 TGF-β1 阳性率为 43%，对照组 TGF-β1 阳性率为 25%，实验组高于对照组.两组率的 χ2 检验，无显著性差异.表 1 各组 EGF，TGF-β1 阳性率统计表略2.1.4 各组实验动物肺泡炎组织病理学分级结果光镜观察结果，各对照组小鼠均未见肺泡炎病理表现，实验组肺泡炎分组结果:1d 组Ⅰ级 6 只，Ⅱ级 2 只，无Ⅲ级.3d 组Ⅰ级 4 只，Ⅱ级 2 只，Ⅲ级 2 只.7d 组Ⅰ级 2 只，Ⅱ级 3。
