绪论1． 生物技术：是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动植物作为反应器，将物料进行加工，以提供产品或用于社会服务的技术2． 中药生物技术：利用生物技术手段，对中药细胞、0组织、个体进行改造，以加快繁殖速度，提高产量，改良品质和抗性等的技术3． 生物技术在中药生产中应用的优点：（1）药材的生产可以在认为控制条件下进行，通过操作培养条件和培养方式极大地提高生产效率2）培养是在无菌条件下进行的，可以排除病菌和虫害的侵扰，严格控制药材质量3）可以进行特定的生物转化反应，大规模生产我们需要的有效成分4）通过对有效成分合成路线进行遗传操作，提高所需物质的量5）通过加入或删除基因而改变药材的遗传特性4．细胞工程：是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科 核心技术是：细胞培养 目的：获得新性状，新个体，新物质5． 植物细胞工程：以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精心操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程。
第一章 细胞全能性与形态发生1．细胞的全能性：一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力 顶端分生组织>居间分生组织>侧生分生组织>薄壁组织>厚角组织>输导细胞>厚壁组织离生长中心越远，即分开程度越高的细胞，其向分生状态回复的可能性就越小离体培养条件下，细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现2．细胞脱分化：指在培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程 脱分化发生在第一次有丝分裂之前，静止细胞启动分裂都是分化细胞成功脱分化的重要标志细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征3．愈伤组织：指脱分化的细胞经过细胞分裂，产生无组织结构，无明显极性的松散薄壁细胞团4．细胞分化：是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程5．再分化：在离体条件下，当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及愈伤组织要重新进入有序生长才能再生为个体的过程6．极性：指植物的器官、组织，甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。
7．离体培养中器官发生的方式：第一种方式是先芽后根；第二种方式是先根后芽，第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根再通过维管组织的联系形成完整植株8．经过愈伤组织再分化器官一般要经过3个生长阶段：第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织；第二阶段是“生长中心”形成；第三阶段是器官原基及器官形成 不经过愈伤组织的器官发生：a.外植体中已存在器官原基；b.外植体细胞重新分裂形成分生细胞团，然后再形成器官原基9．器官分化的影响因素：1.起始材料；2.激素；3.光照；4.器官发生的基因调控 当IAA与KT的浓度比例高时有利于根的形成，比例低时有利于芽的形成在离体条件下，如果用生长素和细胞分裂素处理的顺序不同，其作用也不一样如果先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分裂而不利于细胞分化反之，则有利于细胞分化如果两者同时处理，则可提高分化频率10．体细胞胚：指在离体培养条件下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物 体细胞胚的形成：（1）直接途径：体细胞胚从外植体上直接发生 （2）间接途径：经过愈伤组织的体细胞胚发生，胚性愈伤组织的形成是培养的关键；细胞悬浮培养的体细胞胚发生。
体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点：一是体细胞胚有双极性；二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统联系较少，即出现所谓的生理隔离现象 体细胞胚与合子胚的区别：①合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正的胚柄，只有类似胚柄的结构；②合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，而体细胞胚的子叶常不规范；③与相同植物比较，体细胞胚的体积明显小于合子胚；④体细胞胚不能有明显的脱水干燥过程，则体细胞胚的含水量比合子胚要高得多；⑤体细胞胚还有一个明显的特点是没有休眠 影响体细胞胚发生的因素：（1）外源激素对体细胞胚发生的调控首先在较高浓度下诱导胚性细胞的形成，然后在降低2，4-D的浓度下产生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生长素则有利于体细胞胚的继续发育2）培养基及培养条件对体细胞胚形成的影响体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓度的还原态氮3）不同基因型间体细胞形成能力的差异第二章 离体培养下的遗传与变异1．体细胞无性系：由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系2．嵌合性：是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞它是组织培养中的常见的现象 愈伤组织在大多数情况下是一种具有不同染色体数和不同遗传变异程度的细胞所组成的嵌合体。
3．离体培养细胞的诱变：(1)物理诱变通过射线、磁场及温度等处理；（2）化学诱变常用的有：烷化剂，如硫酸二乙酯（DES）、乙基磺酸乙酯（EES）、甲基黄酸乙酯（EMS）、环氧乙烷（EO）和乙烯亚胺（EI）等；（3）复合因子诱变；（4）转座子插入诱变第三章 植物细胞工程技术原理1．细胞工程的基本技术：（1）洗涤技术 铬酸洗涤液是用重铬酸钾与硫酸配制，仅用于玻璃试验器皿的洗涤，可反复使用，直至溶液为青褐色为止2）灭菌技术 培养基一般采用高压蒸汽灭菌或过滤灭菌高压蒸汽灭菌采用高压灭菌锅，在压力为0.1013Mpa，温度为121℃条件下保持20min进行灭菌处理玻璃器皿可任选湿热或干热灭菌方法灭菌湿热灭菌与培养基灭菌条件一致，但要适当延长灭菌时间，一般以25-30min为宜干热灭菌，即在烘箱中加热至160-180℃后恒温保持40min，或120℃灭菌2h玻璃器皿放入烘箱之前必须完全干燥，以免引起破碎，灭菌时温度要缓慢上升，灭菌后待温度逐渐下降到60℃以下时才能开箱门，以免器皿因突然冷缩而破碎金属用具使用前和使用过程中均必须灭菌并保持无菌状态使用前的灭菌可采用干热灭菌使用过程中的灭菌通常是将其浸泡在70%的酒精中，再以火焰将酒精烧去，待冷却后使用。
操作环境灭菌，其灭菌方法可以通过气体熏蒸或紫外线照射熏蒸剂常用甲醛加高锰酸钾，一般熏蒸期间应将实验室封闭3-5d2．污染是植物组织培养过程中，培养基和培养材料滋生杂菌，最终导致培养失败的现象真菌性污染：在3-8d后培养基中发现各种颜色的菌斑细菌污染：1-2d后发现培养基有黏性液体 污染来源：①植物病原菌；②和植物有关的菌类 控制污染的措施：①采集适宜的外植体；②严格的材料表面消毒；③正确接种操作；④控制适宜培养环境3．无菌操作规程：（1）无菌室、培养室必须经常保持洁净；（2）无菌室在使用前必须用甲醛熏蒸或紫外灯照射0.5h；（3）工作人员进入无菌室前应穿好经消毒的工作服、帽、口罩，用70%酒精洗手；（4）接种工具使用前应彻底灭菌，用完后及时消毒；（5）接种材料要严格消毒灭菌，即要彻底灭菌，又要不伤材料；（6）整个接种操作过程应在酒精灯火焰前进行；（7）继代培养材料不要消毒，但也应谨慎操作，避免污染4．用于植物离体培养的培养基一般包括无机盐，有机化合物和生长调节剂三大基本组成成分 （1）无机盐类：可分为大量元素和微量元素大量元素包括碳、氢、氧、磷、钾、钠、钙、镁和硫微量元素包括铁、锰、铜、锌、硼、钼、钴等。
（2）有机化合物：①糖类 加入一定浓度2%-3%糖，既可作C源，又可维持渗透压；②维生素；③肌醇 促进细胞壁再生，细胞膜构建；④氨基酸 常用甘氨酸 （3）生长调节物质：①生长素类 生长素引导愈伤组织的形成和促进根的分化形成2，4-D常抑制器官发生，诱导愈伤组织；NAA可以引导分化方向，调节细胞分化；IBA促进不定根形成活性：2，4-D>NAA>IBA>IAA②细胞分裂素 促进愈伤组织或器官分化出不定芽；促进细胞分裂与扩大；抑制根的分化③赤霉素 具有促进细胞伸长生长，诱导花芽形成，打破种子休眠以及诱导单性结实等生理功能；④水；⑤其他附加成分，如琼脂、活性炭在生根培养时，须加活性炭，防止组织玻璃化现象5．培养基配方及培养基选择 培养基根据其中无机盐成分和元素浓度分为4类：富盐平衡培养基，高硝态氮培养基，中盐培养基，低盐培养基其中富盐平衡培养基中的MS培养基是目前使用最广泛的植物培养基特点：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，因而在培养过程中可维持较好的稳定性，营养丰富在培养中，无需额外加入有机成分；微量元素种类全，浓度高离体培养中细胞分裂素和生长素的配比原则是：当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；诱导芽分化时，细胞分裂素水平应高于生长素水平；诱导根分化时，则应提高生长素水平。
配制母液注意事项：①防止无机成分混合时，可能发生化学反应生成沉淀；②必须使用高纯度的蒸馏水；③药品应采用分析纯试剂；④化学试剂的称量及定容必须准确一） 培养基母液配制为了便于操作和配制浓度的精确，通常将培养基的不同成分先配制成较高浓度的母液，使用时按比例稀释成需要的浓度二） 培养基的制备6． 培养材料的选择种类和确定(1)快速繁殖培养材料的确定：a．药用疗效好，经济价值高，而自然繁殖数低，且相当困难的药用植物b．珍稀濒危的药用植物c．性状不一致的杂合型植株，优良芽变品种和优良单株d．刚从国外引进的数量少，经济价值高的种类e．新选育出来的需扩大繁殖的新品系，杂交种f．新获得的三倍体、多倍体、突变体和“基因工程株”等g．需要除去病毒的大面积生产的品种2）工业化生产药用有效成分的培养材料的确定：a．有效成分明确，并有可靠质量鉴定指标的药用植物b．有肯定的疗效和使用价值，经济价值高的药用植物c．含有医疗急需的，疗效很好的有效成分，而化学合成困难或成本高的药用植物d．某些有特殊疗效的药用植物，但原植物所含的有效成分相当低，提取率低，成本高且资源稀少e．野生资源贫乏，大面积生产栽培技术困难，而且相当紧缺的药用植物。
7．用于外植体分离的母体植物材料一般有3种来源：①生长在自然环境下的植物；②有目的地培育在温室控制环境条件下生长的植物；③无菌环境下已经过离体培养的植物应尽量取生长旺盛期的生长点部位作为起始培养的外植体或从高含量次生代谢物合成部位的母体上选择外植体外植体灭菌：先冲洗干净，在用75%乙醇处理，再加0.1%-0.2%消毒剂（氯化汞），浸泡2-10分钟，再用无菌水多次冲洗残液8． 接种培养及培养条件的控制 （1）光照 离体培养的光照调节包括光照强度，光照时间和光质的控制外植体的培养初期和在愈伤组织增值阶段，一般在黑暗条件下或在弱光照下培养比较好在器官分化阶段，高强度的光照是必要的，一天12—14个小时左右 （2）温度 植物组织培养常用的温度一般在20~30℃ （3）培养基PH 离体培养时，培养基的PH一般在5.5~6.0 （4）气体调节；（5）渗透压；（6）湿度第四章 植物组织和器官培养1．植物脱毒：利用植物组织培养技术，脱出植物细胞中侵染的病毒，生产健康的繁殖材料 脱毒的方法。