专业：应用生物科学 班级：13应生 姓名：张寿丽 学号：134120258实验二、光合色素的提取、理化性质、分离、吸收光谱及含量的测定一、实验目的：1、掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质2、掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱3、掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法二、实验原理：1、光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等2、提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象3、 离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭 到破坏，形成加氧叶绿素等产物4、 叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应5、 叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+ 等离子所取代6、 不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对 它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开7、 叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光8、 混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律（A = k L 0求出各组 分含量Lambert定律：A = k L； Beer定律A = k C。
叶绿 素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm,由此 得出：见推导过程Ca = 12.7 A663 - 2.69 A645； Cb = 22.9 A645 - 4.68 A663 Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A6459、 A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1A645 = Cb.kb2 + Ca.ka2 分光光度计测出，故求二元一次方程组可得到此公式10、 k――比吸收系数即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓 度（C）为1g/L（0.1%），比色皿的直径（光径，L）为1cm时所测 出的吸光度即为比吸收系数11、 e ――摩尔吸收系数即溶剂和波长不变的情况下，当物质的 浓度（C）为1mol/L，比色皿的直径（光径，L）为1cm时所测出 的吸光度即为摩尔吸收系数三、实验药品及仪器：（一）、材料：叶子花的叶片二）、药品：碳酸钙、石英砂、丙酮、30%K0H甲醇溶液、苯、50%醋酸、 醋酸铜、80%丙酮、石油醚三）、仪器： 解剖剪、滤纸、漏斗、吸量管、试管，三角瓶、洗耳球、离心 管、研钵、酒精灯、分光光度计、便携式叶绿素测定仪、离心机、 试管夹、试管架。
四、方法及步骤：（一）、光合色素的提取： 将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/2片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml 丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用1、荧光现象：与光线垂直的方向观察色素颜色2、光破坏作用：1ml色素提取液于室内，1ml于太阳光下，30min 后观察颜色变化3、 皂化反应：取一支试管，加入色素提取液2.5ml，再加入30%KOH 甲醇溶液1ml,摇匀，再加入苯2.5ml，轻轻摇动，沿试管壁慢 慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的 变化4、 取代反应：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直 至溶液变为黄褐色倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上 加热，与另一半比较颜色的差异二）、光合色素的分离和吸收光谱：1、光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/3片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分 研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角 瓶中，待用2、 光合色素分离：剪取适当长度和宽度的滤纸条一用上行纸层析法分离色素f启动剂：石油醚：丙酮：苯=10： 2： 1。
3、 吸收光谱的测定：（1）、光合色素的吸收光谱：取色素溶液1 mL，加入丙酮3 mL， 摇匀后在分光光度计上400到700 nm处每隔10 nm进行扫描2）、各色素的吸收光谱：上述层析出的3~4种色素，分别剪下 后溶于3 mL丙酮中，按上述方法扫描三）、光合色素含量的测定：1、 快速测定法：由于叶绿素a、b在652nm处有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶 片的叶绿素含量，最后浓度单位为mg/dm22、 分光光度计法：色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸 干，准确称取已知①的叶圆片0.05g，加入少许CaCO3和石英砂及80%丙酮2ml,充分研磨，转入离心管中（离心机使用）， 再用5ml 80%丙酮洗研钵，转入离心管中，平衡，5000rpm离心 10min, 记录上清液体积，取 1ml 稀释到 4ml测定：以1cm比色皿分别测定A663、A645使A控制在0.1 ~ 0.8 之间五、结果及分析：（一）、光合色素的提取及其理化性质：1、荧光现象：色素提取液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色 分析：当叶绿素分子吸收收光子以后就由最稳定、最低能量的基态 上升到一个不稳定的、高能状态的激发态，激发态及其不稳定，停 留时间一般不超过几纳秒就迅速向较低能状态转变，转变的途径有 将光能转变为热能、光能及经激发态的叶绿素将光能传递给附近的 其它分子等三个途径，荧光现象即由转变为光能的途径中转变为荧 光的途径引起，仅占三条去路中的0.5%。
2、 光破坏现象：色素提取液在阳光照射 30min 后由绿色变为褐 色分析：离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结 构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物，该产物呈褐色，故叶绿素 提取液变为了褐色3、 皂化反应：在色素提取液中加入30%K0H甲醇后溶液由绿色变 为灰绿色；再加入苯以后分为上黄绿，中浅绿，下深绿三层； 加入水震荡后变为上层黄绿下层深绿两层分析：叶绿素分子是一种羧酸脂，能发生皂化反应4、取代反应：加入硫酸铜粉末并在酒精灯上加热的溶液由黄色变为绿色分析：叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子 所取代加入醋酸后H+取代了 Mg2+形成黄褐色的去镁叶绿素，加入硫酸铜粉末 后H+又被Cu2+取代，形成蓝绿色的铜代叶绿素二）、光合色素的分离和吸收光谱：1、光合色素的分离：滤纸条上自上而下出现黄橙色、黄色、蓝 绿色、黄绿色四个色带，蓝绿色和黄绿色两个色带更加清晰分析：不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物 对它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开3、吸收光谱的测定：（1）、未层析的光合色素的吸收光谱如图所示：400~500nm为蓝光区，650~700nm为红光区，图上在这两个区域 出现了吸收峰，故它们主要吸收的光为红光和蓝光。
2）、叶绿素 a 的吸收光谱如图所示：图中在 400nm 处显示有两个吸收峰，在 700nm 附近的光区有一个 吸收峰，在 400nm 光区附近的第一个吸收峰是叶黄素的吸收峰， 应该是叶绿素 a 提取液受到了叶黄素的污染，其余两个吸收峰则 是叶绿素 a 吸收峰3）、叶绿素 b 的吸收光谱如图所示：图中在 450nm 附近显示有两个吸收峰，在 700nm 处有一个吸收峰, 在 450nm 前方的吸收峰是叶黄素的吸收峰，其余两个吸收峰则是 叶绿素 b 的吸收峰，叶绿素 b 提取液受到了叶黄素的污染9.50AQM [ .400血刖碱r\?00t9ni（I®叶绿耒b（4）、叶黄素的吸收光谱如图所示图中 450nm 附近有两个吸收峰0.50 AKip口的血杆w存I俊叮負柔0JOA] 400.0饰■（5）、胡萝卜素的吸收光谱如图所示： 图中在 450nm 光区附近有一个吸收峰O#30A三）、光合色素含量的测定：1、用便携式叶绿素测定仪测定出该叶片叶绿素的含量0■朗百I - _40U * Ddm J,MEW®砒卜束53.1mg/dm22、用分光光度计测得：离心后上清液的体积为4.7ml,叶片质量为0.05g。
A663=0.479 A A645=0.199ACa =12.7 A663 - 2.69 A645 =5.54799A叶绿素a在叶片中的含量为：Ca*4*4.7/(0.05*1000)mg/g=2.086mg/gFWCb =22.9 A645 - 4.68 A663=2.31538 A叶绿素b在叶片中的含量为：Cb*4*4.7/(0.05x1000)mg/g=0.871mg/gFWCa+b = 8.02 A663 + 20.20 A645=7.86138A叶绿素a、b在叶片中的含量为：Ca+b *4*4.7/(0.05*1000)mg/g=2.956mg/gFW结论：叶子花叶片中叶绿素a的含量为2.086mg/gFW，叶绿素b 的含量为0.871mg/gFW,叶绿素a+叶绿素b的含量为 2.956mg/gFW六、思考与讨论：1、为什么在皂化反应中只能用 20%KOH 甲醇溶液，而不能用20%K0H水溶液？答：皂化反应是酯水解反应的一种酯水解反应本身就有速率慢， 反应不彻底的缺点，而光合色素的水溶性又很差，用氢氧化钾的 水溶液势必会浪费很多原料而用甲醇，能使反应物充分接触， 有利于增加反应速率和提高原料利用率。
2、 光合色素的吸收光谱对我们理解光合作用有何意义？ 答：它是叶绿体吸收光能进行光合作用的证据，可以解释清楚光 合作用吸收和不吸收的光区，助于我们队光合作用具体机制的理 解3、 试论述高等植物光合色素的种类和生理功能答：叶绿素a：能收集和传递光能，少数处于激发状态的叶绿素 a可以将光能转化为电能进行光合作用叶绿素b:收集和传递光能 叶黄素和胡萝卜素：收集和传递光能，防止叶绿素的光氧化4、 两种测定方法含量有何不同？为什么？答：快速测定法用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含 量，局部含量测定比较准确，但不便于整体测定，取样多次平 均值也不能代表整体叶绿素含量；分光光度计法采用低杂散光， 高分辨率的单 光束单色器，保证了波长准确度•波长重复性和更高 的分辨率，自动调0%T和100%T,自动调波长用多种方法的数据 处理功能，高分辨，宽 大的样品糟，可容纳100mm，光径吸收池和 相应的反射附件，仪器配有标准的RS-232双向通讯接口，可外 接打印机，打印相应的实验数据•个性代的外形设计，轻触式按键 使操作更为方便.可见分光光度计广 泛应用于医药，卫生，化工， 学校，生物化学，石油化工，质量控制，环境 保护及科研实验室等化 学分析。
5、 怎样把方法一中的叶绿素含量mg/dm2转换为方法二中的mg / g FW ?怎样测定不同形态的植物叶片的叶面积？答：设该叶片中叶绿素的质量为ml，算出含有ml叶绿素所需叶片 的体积，取出与该体积相同大小的叶片，称重，称出叶片的质量 m2， m1/m2 即可方法一：选取单位面积重量是一个常数的打印纸如A4或16K一 般A4打印纸为70~105GSM (g/m2)用铅笔轻轻地沿着叶缘在A4 纸上划线用剪刀沿着叶缘剪下A4纸称所剪下的A4纸的重量W (g),叶的面积=W/GMS方法二：阿基米德定律。