动物细胞与组织培养技术第一节 概述第二节 动物细胞、组织培养的基本方法 第三节 培养细胞的检测和特性鉴定 第四节 动物细胞体外培养举例 第五节 细胞同步化v 一、动物细胞与组织培养的基本概念 v 二、动物细胞体外培养的特点 v 三、发展历史 v 四、动物细胞的体外培养一般条件v 五、体外培养细胞生物学特性 第一节 概 述 一、基本概念1．动物细胞与组织培养(Cell and Tissue Culture) ：用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模拟体内的 生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或组织生 存、生长并维持结构和功能的一门技术 动物细胞工程的基础 v分类： 细胞培养Cell Culture 组织培养Tissue Culture 器官培养Organ Culture2、原代培养(Primary Culture)：初代培养，直接从机 体取出的细胞或组织进行培养的过程3．继代培养（ Secondary Culture ）：传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养.4、细胞系(cell line)：由原代细胞培养后经初步纯化 ，获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的不均 一的细胞群体，一般为有限细胞系。
5、细胞株(cell strain)：细胞系经过克隆或其他方法 获得、由单细胞形成的单一类型的细胞群体有限细胞系(infinited cell line)：不能连续培养的 细胞系 无限细胞系(finited cell line)：能够连续培养的细 胞系，大多已异倍化，异倍体核型，或成为恶 性细胞 限定性细胞系：具有特定实验指标的细胞系 限定性细胞株：具有特定实验指标的细胞株细胞株、细胞系的命名：组织来源，如BHK(幼地鼠肾细胞Baby Hamster Syrian Kidney)人名，如HeLa细胞时间地点，如S7811细胞系临床疾病类型，如BALL-1细胞系(B淋巴细胞急性白血病人白细胞B Acute Lymphocytic Leukemia )用于生产的 动物细胞株原代细胞二倍体细胞融合细胞基因工程细胞转化细胞 常用细胞株CHO细胞：理想的真核表达系统，疫苗、蛋白质药物Vero细胞：非洲绿猴的肾脏上皮细胞 疫苗BHK-21细胞：疫苗、接毒WI-38细胞： Normal Human Fetal Lung Fibroblast 人胚肺成纤维细胞 ，有限传代，细胞老化、癌症研究对照材料、病毒感染材料二、动物细胞体外培养特点v动物细胞生长缓慢，培养时间长。
v更易受微生物污染 （包括细菌、真菌、病毒、支原体）， 需要防治污染问题v对培养环境的适应性差，对环境极其敏感包括pH值、温度、剪切力v对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清 v原代细胞一般繁殖50代左右退化死亡总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大形态多种多样：圆形、椭圆形、正方形、柱形、扁平形、梭形、星形和多边形等平滑肌细胞神经元细胞血红细胞三、动物细胞培养的发展历史v1885年，Wilhelm Roux （德国）最先尝试离体 培养鸡胚神经板，存活了数月建立“组织培养”概念 v1907年，美国胚胎学家Ross Harrison 培养蛙胚 神经细胞长出了轴突，存活了几周（盖玻片覆盖 凹窝玻璃悬滴培养法）；创立了体外观察和研究动物组织的方法公认为动物组织培养的开山鼻祖 v法美学者Alexis Carrel1912年 将外科无菌概念和无菌操作技术引入到组织 培养中；采用鸡胚匀浆组织液与血浆混合使用，培养了各种 动物组织的组织块；采用更新培养基和分离组织的传代措施，使鸡胚心 肌细胞维持生存34年，传代3400次，证明离体的动 物组织在培养条件下有可能无限地生长和繁殖。
1923年，他设计了卡氏培养瓶，首先鸡胚心肌组织 取得成功以后，已使多种动物组织培养获得成功v1913年，Steinhardt建立了单盖片悬滴培养法 v1925年，Maximow采用双盖片法 v1934年，Gey和Lewis 用旋转管培养了许多细胞系相继，人们设计了多种类型的培养瓶v1940年，Earle首创单个细胞克隆培养的方法，建立了可无限 传代的C3H小鼠结缔组织细胞系 v1948年，Sanford创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞系他还创建了单个细胞培养方法 v1951年， Dulbecco等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了单层细胞培养单层培养法的出现，极大 地推动细胞培养的发展，利用该技术建立了很多细胞系单 层培养成了细胞培养普遍应用的技术v1951年，Pomerat设计了细胞培养灌流小室技术，使细胞生活在不断更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代 谢等研究v1951年， Earle发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基v1952年，Gey建立了第一个人体细胞系，人体宫颈癌Hela细胞系 v1960年，Barski等人在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的融合细胞。
v1962年，Okada又发现了已灭活的仙台病毒可以诱发体内艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合且融合细胞染色体丢失 ，恶性特征受到抑制培养器皿：从载玻片发展到培养瓶、培养皿、培养板培养液：从天然动物血浆、胚胎渗出液发展到人工合成 培养基(或称限定培养基)；促细胞生长物质从胎汁改 用动物血清、近几年发展起来的无血清培养系统培养技术：从实验室小规模培养发展到微载体、微囊、 中空纤维式、悬浮式等大型生物反应器培养，促进了 细胞培养技术的应用与发展四、动物细胞的体外培养一般条件1. 1. 无污染环境无污染环境 2. 2. 温度温度3. pH3. pH 4. 4. 气体气体 5. 5. 营养营养 6. 6. 培养基培养基 7. 7. 附着底物附着底物1. 无污染环境培养环境的无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件细胞培养室：福尔马林＋高锰酸钾或过氧乙酸蒸气熏蒸进行消毒；培养器皿及用品：高压蒸气灭菌进行灭菌；培养液：0.22 m微孔滤膜过滤除菌滤 器2、温度v恒定适宜的温度v培养细胞对低温的耐受力高于高温，温度不超过39℃时，细 胞代谢与温度成正比；v人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离此范围， 细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。
一般鱼类细胞最适 温度不超过30℃，鸟类细胞要求温度为38.5℃；低温使细胞代谢速率降低，20-25℃能缓慢生长繁殖4℃下能维持相 当长时间，无明显损害;人体细胞在39-40℃ 1小时，受到一定损伤，但仍可能恢复；40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有 恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡3、pH：最适7.2～7.4 v大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离该范围对细胞培养将产生有害的影响；每种细胞都有其最适pH值；v细胞耐酸性比耐碱性强，偏酸环境中更利于细胞生长；v有些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如成纤维细胞最适合pH是7.4-7.6；vpH低于6或高于7.6时生长会受到影响，甚至死亡v常用磷酸缓冲剂，适用于封闭式培养；vHanks平衡盐溶液中含有高浓度的NaHCO3，打开培养瓶时，CO2迅速逸出 而导致培养液pH变碱，酚红指示剂变红；vHEPES 对细胞无毒性，能防止pH迅速变动，其最大优点是在进行活细胞观 察时能维持较恒定的pH4、 气体v气体：需要O2、CO2 （95%空气、5% CO2）O2 ：参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
v低于大气压的氧压适于细胞株生长；v高氧压（高达95%）适于器官培养，但对于胚胎组织及细胞株单层的生长会产生致死性的伤害CO2 ：既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁 殖所需成分，主要作用在于维持培养基的pH 值v在细胞代谢中， CO2是三羧酸循环的最终产物 之一，被培养基中的阳离子所固定，或与丙酮 酸结合生产草酸，这些反应均可促进三羧酸循 环v培养系统中CO2张力的维持，能使细胞培养物存 活期延长，提高细胞培养技术v二氧化碳培养箱，定时补充CO2 ，维持一定的 CO2张力 5、营 养要求高，需要：碳水化合物、氨基酸、脂类无机盐、维生素、辅酶核酸、激素、生长因子 v碳水化合物细胞培养的主要能量来源；合成某些氨基酸的原料；经过乙酰辅酶A(CoA)可合 成脂肪；经过糖解磷酸通路能合成核酸；葡萄糖最重要、最常用，4.5g/L高糖或1.0g/L 低糖；果糖、甘露糖、磷酸葡萄糖及半乳糖等单糖也可作 为细胞培养的能源；双糖或多糖先分解为单糖也可用于细胞培养Ø氨基酸与蛋白质 ü绝大多数细胞培养物不能利用蛋白质，细胞本身所需要的蛋白质是由摄取的氨基酸合成的；ü12种必需氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸 、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨 酸、酪氨酸、缬氨酸。
ü所有细胞都需要谷氨酰胺，能促进各种氨基酸进入细胞 膜；ü氨基酸可作为细胞培养的能量来源；ü培养基中常加入蛋白质和多肽，能促进细胞迅速生长Ø维生素ü细胞的生长繁殖需要多种B族维生素，大多数是与合成和代谢活动密切相关的各种辅酶、辅基；ü必需维生素：肌醇、硫胺素、核黄素、吡哆醇、泛酸、叶酸、烟碱酸、生物素、胆碱、 对氨基苯甲酸； ü常用限定培养基中已成为固定组成成分v细胞培养的辅助因素Ø非必需氨基酸：虽然细胞能合成这些氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、 脯氨酸，适量加入能促进细胞的生长，特别是当细胞接种量很小时；Ø其它维生素及辅酶 ：维生素A对于纤毛圆柱上皮细胞的分化很重要 ；如果用辅酶的形式代替B族维生素加入培养基中，细胞生长会更好， 如辅酶A、腺嘌呤核黄素；Ø核酸：虽然细胞能利用简单的分子如甘氨酸、二氧化碳、甲酸钠等合成核酸，但它们会优先利用培养基中的核甘酸； Ø激素：促进细胞的生长与增殖，影响细胞的生长与分化细胞－组织培养技术也是研究激素作用的重要工具；Ø血清：可以提供细胞生长所需的各种激素和生长因子，是维持细胞有丝分裂不可缺少的物质6. 培养基v天然培养基动物体液、组织提取液：血浆、血清、组织提取液、鸡 胚汁等；优点：营养成分丰富，培养效果良好；缺点：成分复杂，来源受限，个体差异。
v合成培养基 平衡盐溶液； 限定培养基；无血清培养基v血清能提供细胞生存、生长和增生所必需的激素和生长调节因子，如胰 岛素、肾上腺素、肾上腺皮质激素、类固醇激素、成纤维细胞生长 因子、表皮细胞生长因子、血小板生长因子等；能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分，如各种氨基酸、维 生素、无机物、多肽、脂类、核酸衍生物等都是细胞生长所需的基 本营养物质；含有许多结合蛋白：对激素、维生素、脂类等具有稳定和调节作用； 同时结合有毒性的金属离子和热原质，起到解毒作用；含有蛋白酶抑制因子：保护细胞免受环境中蛋白酶的损伤；还含有一些供贴附型细胞在培养皿表面贴附和铺展的生长基质成份， 如纤粘连蛋白、层粘连蛋白等；种类：牛、人、马、兔、猪、羊血清，最常用的是胎牛血清与新生牛 血清；血清的使用浓度一般为5％～20％，常用浓度为10％；使用前必须经过鉴定，只有无菌、无支原体、无内毒素、无溶血或低 溶血、蛋白质及必需营养素达到一定标准以上的血清才能使用Ø水解乳蛋白和胶原Ø另外两种较好的天然培养基成分；Ø水解乳蛋白：乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产 物，呈淡黄色粉末状，富含氨基酸；Ø胶原：从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特 性促使其附着生长的作用。
v人工合成培养基Ø平衡盐溶液（Balanced salt solution，BSS）： 维持细胞短期成活的培养基v组成：无机盐、葡萄糖、水v作用：保持组织细胞生理状况所要求的渗透压与pH，维持 细胞短期成活；洗涤、分散、分离培养的组织细胞；配制 细胞消化液；用作某些合成培养基的基础液v种类：弱磷酸缓。