制药用水在微生物限度检查方面的研究 摘要：在符合药典要求下，对原有制药用水微生物限度需氧菌检验方法进行优化并对优化后的检验方法进行确认方法：在样品取样量不变的情况下，改变冲洗剂量查看检测结果是否有变化结果：验证过程顺利，利用薄膜过滤法确定纯化水、注射水以及纯蒸汽检验方法按照新方法执行对检测结果无影响结论：新方法在污染菌的检出率较现行方法不变的前提下，在检验效率以及费用上有显著提高关键词：制药用水、微生物限度、薄膜过滤法、提高效率引言：药品生产用水的质量直接影响到药品的质量，因此制药用水的质量控制，特别是微生物学指标的控制极其重要企业在建立微生物污染监测方法时，需要从方法的灵敏度、污染菌检出率、样本量、培养时间、费用以及技术的复杂性等方面去综合评价，找到最适宜的方法并长期追踪1. 仪器与材料：生物安全柜（BIOBASE），1XG1.C型普通卧式压力蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；薄膜过滤器（德国赛多利斯公司）；0.45μm无菌滤膜（泰林生物）验证用供试品 注射用水：选取三个点位的注射用水三个点位的纯蒸汽验证用玻璃器具：于121℃灭菌30分钟后方可使用，仪器：镊子、100ml滤杯，100ml量筒验证用培养基及缓冲液：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）；沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）；胰酪大豆胨液体培养基(TSB)；pH7.0无菌氯化钠-卵白胨缓冲液(SCB)；R2A琼脂培养基(R2A)；含0.05％（v/v）聚山梨酯80 的pH7.0无菌氯化钠-卵白胨缓冲液。
标准菌株：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉2. 方法与结果：2.1供试品：注射用水、纯蒸汽2.2计数方法验证：2.2.1注射用水计数方法验证2.2.1.1实验组：将不大于100cfu的菌液和100ml供试品倒入过滤器中，过滤用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数2.2.1.2菌液组：将不大于100cfu的菌液及100mlpH7.0无菌氯化钠-卵白胨缓冲液注入过滤器中，过滤，用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数2.2.1.3供试品对照组：将100ml供试品注入过滤器中，过滤，用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数2.2.1.4培养与计数：采用R2A琼脂培养基于30～35℃培养5天（供试品对照组培养5天5小时），繁育结束点计菌落数并报告2.2.2纯蒸汽计数方法验证2.2.2.1实验组：将不大于100cfu的菌液及100ml供试品注入过滤器当中，过滤用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数2.2.2.2菌液组：将不大于100cfu的菌液及100mlpH7.0无菌氯化钠-卵白胨缓冲液注入过滤器中，过滤，用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数。
2.2.2.3供试品对照组：将100ml供试品注入过滤器中，过滤，用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数2.2.2.4培养与计数：采用R2A琼脂培养基于30～35℃培养5天（供试品对照组培养5天5小时），繁育结束点计菌落数并报告2.2.3纯化水计数方法验证2.2.3.1实验组：取50mlpH7.0无菌氯化钠-卵白胨缓冲液注入过滤器中，然后将将小于等于100cfu的菌液及1ml供试品注入过滤器中，过滤用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数2.2.3.2菌液组：取50mlpH7.0无菌氯化钠-卵白胨缓冲液注入过滤器中，加入不大于100cfu的菌液，过滤后，用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数2.2.3.3供试品对照组：取50mlpH7.0无菌氯化钠-卵白胨缓冲液注入过滤器中，然后将1ml供试品注入过滤器中，过滤后，用灭菌镊子取出滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，测定其菌落数2.2.3.4培养与计数：采用R2A琼脂培养基于30～35℃培养5天（供试品对照组培养5天5小时），繁育结束点计菌落数并报告2.2.4验证公式：实验组的菌落回收率=2.2.5结果判断：完成三次独立的平行实验后，计算每一次验证实验的结果，即实验组的菌落回收率的结果，应在0.5～2.0范围内。
若实验组的菌落回收率均在此范畴内，则平皿计数方法验证可行若任一次实验中任一实验菌株实验组菌落回收率不在0.5～2.0范畴内，先按照从操作者、机械设备、物料、操作方法、环境条件等方面逐一查找原因，然后按照《偏差调查处理SMP》进行分析，如为操作者、设备、物料、操作方法、环境条件等因素，应重新进行实验，如非上述因素造成菌落回收率不在0.5～2.0范围内，则标明供试品在此查验前提下有抑菌作用，那么应采用相宜的除去抑菌活性方式，并重新进行验证实验按照消除抑菌活性的方法选用其他方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并从新举行方法实验2.3数据汇总2.3.1验证项目见表1表1：验证项目验证项目验证内容验证结论注射用水需氧菌总和计数方式验证采用薄膜过滤法计数，三次独立平行实验，每一株菌株的实验组的比率均在0.5-2.0范畴符合规定纯蒸汽需氧菌总和计数方式验证采用薄膜过滤法计数，三次独立平行实验，每一株菌株的实验组的比率均在0.5-2.0范畴符合规定纯化水需氧菌总和计数方式验证采用薄膜过滤法计数，三次独立平行实验，每一株菌株的实验组的比率均在0.5-2.0范畴符合规定2.3.2数据汇总表2：注射用水结果汇总表菌种名称实验号实验组（cfu）菌液组（cfu）供试品对照组（cfu）菌落回收率金黄色葡萄球菌1625801.12646201.03616700.9铜绿假单胞菌1434700.92404300.93424500.9枯草芽孢杆菌1586400.92576600.93627100.9白色念珠菌1454701.02434900.93424401.0黑曲霉1414500.92444401.03434700.9表3：纯蒸汽结果汇总表菌种名称实验号实验组（cfu）菌液组（cfu）供试品对照组（cfu）菌落回收率金黄色葡萄球菌1596800.92626201.03616800.9铜绿假单胞菌1444900.92414201.03454201.1枯草芽孢杆菌1576900.82636201.03616600.9白色念珠菌1475500.82515400.93525700.9黑曲霉1414900.82435000.93484101.2表4：纯化水结果汇总表菌种名称实验号实验组（cfu）菌液组（cfu）供试品对照组（cfu）菌落回收率金黄色葡萄球菌1637000.92616700.93656900.9铜绿假单胞菌1414500.92434001.13424101.0枯草芽孢杆菌1606700.92586500.93637000.9白色念珠菌1485001.02465400.83505500.9黑曲霉1434101.02454900.93414500.93.结论 《药品生产质量管理规范》中规定，理当对制药用水进行定期检测，发现制药用水微生物污染到达警戒限度、纠偏限度时应当按照操作规程处理，制药企业应对制药用水微生物污染情况进行长期的跟踪监测，掌握其趋势变化，适时采取必要的措施保证制药用水质量持续符合法规要求，那么，适宜的制药用水微生物污染监测手段显示出尤为重要。
R2A琼脂培养基，30-35℃，培养5天5小时的培养体系，该方法灵敏度高，有利于大多数水系统中污染菌的检出R2A琼脂培养基属于低营养培养基，一般来说更有利于分离成长缓慢的细菌和营养要求较低的细菌，但是一些富养菌也能够在R2A琼脂培养基上生长，5天的培养时间有利于受损微生物，缓慢生长的微生物以及生长要求苛刻的微生物的检出改进后的方法科学合理，对培养结果并无影响的同时节省材料时间，提高工作效率参考文献：[1]张光华，中国医药工业杂志 Chinese Joumal of Pharmaceuticals 2015,46(12)[2]高惠璇,应用多元统计分析【M】.1版，北京：北京大学出版社，2005.[3]药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014.34(2) -全文完-。