1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质但至 目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内 膜等原材料，- 105 - 蛋白质提取与制备 Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些原料的选择主要依据实验目的定从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源 丰富及成 本低的原料尽量要新鲜原料但有时这几方面不同时具备含量丰富但来源 困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者一般 要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素 C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶 要事前调查 制备的难易情况若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响如利用胰 蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料 的来源种属 必须一定研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白） 时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料可能时尽量用全年均可采到 的原料对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素 也要注意。
2、前处理a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理要剔除结缔组织及脂肪组织如不能立即进行实验， 则应冷 冻保存除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离 提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中不同生物体或同一生物体不同的组织，其 细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀 浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨 ⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏常用器械有：①高速组织捣碎机（转 速可达lOOOOrpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃 匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料 等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较 小小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细但 在磨细时局部往往生热导致变性或 pH 显着变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时磨细剂的吸附 也可导致损失⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法I反复冻融法于冷藏库或干冰反复于零下15〜20°C使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操 作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。
由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性， 冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性II冷热变替法将材料投入沸水中，于90C左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却， 绝大部分细胞被破坏III超声波法暴露于 9〜10 千周声波或 10〜500 千周超声波所产生的机械振动，只要有设备 该法方便且效果也好，但一次处理量较小应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存 在处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重W加压破碎法加一定气压或水压也可使细胞破碎 ⑶化学及生物化学方法I有机溶媒法粉碎后的新鲜材料在0C以下加入5〜10倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细 胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末用 少量乙醚洗，- 106 - 蛋白质提取与制备 Protein Extraction and Preparation 经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性II自溶法将待破碎的鲜材料在一定 pH 和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏， 使细胞内含物释放出来比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化利用该法可 从胰脏制取羧肽酶自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。
应防止细菌污染于温 室30C左右较早溶化自体融解过程中PH显着变化，随时要调节pH自溶温度选在0〜 4C,因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用Ill酶法与前述的自体融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质但值得提出的是 溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类能溶解菌的酶分布很广尤其 卵白中含量高，而多易结晶化1g菌体加l~10mg溶菌酶，~内完全溶菌于生理食盐 水或 蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出除溶菌酶外，蜗牛酶 及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用 表面活性剂处理较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等 此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀 破b、细胞器的分离 制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定 细胞器上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先 行分离，对于制备一些难度较大需求纯度较高的生物大分子是有利的尤其近年来分子生物 学、分子遗传学、遗传工程等学科和技术的发展，对分布在各种细胞器上的核酸和蛋白质的 研究工作日益增多，分离各种细胞器上的各类核酸和特异性蛋白质已成为生物大分子制备工 作重要内容之一。
各类生物大分子在细胞内的分布是不同的 DNA 几乎全部集中在细胞核 内 RNA 则大 部分分布于细胞质各种酶在细胞内分布也有一定位置因此制备细胞器上的 生物大分子时， 预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所了解以肝细胞 为例整理如表1表1 蛋白质、酶及核酸在肝细胞内分布情况 细胞器名称 主要蛋白质及酶类 核酸类 细胞核 精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系 RNA 占总量 10%左右 DNA 几乎全部粒线体 电子传递、氯化磷酸化、三羧酸循环、 脂肪酸氧化、氨基酸氧化、脲合成等酶系RNA 占总量 5%左右 DNA 微量内质网（微粒体） 蛋白质合成酶系、羟化酶系 RNA 占总量 50%左右 溶酶体 水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、组织蛋白酶及糖苷及糖苷酶等）高尔基氏体 糖苷转移酶、粘多糖及类固醇合成酶系细胞膜 载体与受体蛋白、特异抗蛋、ATP酶、环化腺苷酶、 5'-核苷酸酶、琥珀酸 脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶等 细胞液 嘧啶和嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、 可溶性蛋白类RNA （主要为tRNA）占总量30%- 107 - 蛋白质提取与制备 Protein Extraction and Preparation 细胞器的分离一般采用差速离心法。
细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心利 用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组 分细胞器的分 离制备、介质的选择十分重要最早使用的介质是生理盐水因它容易使亚细 胞颗粒发生聚集作用结成块状，沉淀分离效果不理想，现一般改用蔗糖、Ficoll （—种蔗糖多 聚物）或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液 水溶液提取： 大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中因此蛋白质的提取一般以 水为主稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶 剂盐溶液提取： 以盐溶液及缓冲液提取蛋白质进常注意下面几个因素盐浓度等渗盐溶液尤以〜L磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用L 氯化钠溶液应用也较多如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用 L 碳酸氢钠 液提取等有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合， 也常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液有些蛋白质在低盐浓度下浓度低， 如脱氧核糖核蛋白质需用lmol/L以上氯化钠液提取总之，只要能溶解在水溶液 中而与细胞颗粒结合不太紧密的蛋白质和酶，细胞破碎后选择适当的盐浓度及 PH, —般是不难提取的只有某些与细胞颗粒上的脂类物质结合较紧的，需采 用有机溶剂或加入表面活性剂处理等方法提取。
PH 值：蛋白质提取液的PH值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等 电点两侧如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大 蛋白质的溶解度，提高提取效果如细胞色素C属碱性蛋白质，常用稀酸提取， 肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱提取某些蛋白质或酶与其分 物质结合常以离子键形式存在，选择PH3〜6范围对于分离提取是有利的温度：多数酶的提取温度在5°C以下少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适 当提高温度，使杂蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化如胃蛋白酶等 及许多多肽激素类，选择37〜50C条件下提取，效果比低温提取更好 此外提取酶时加入底物或辅酶，改变酶分子表面电荷分布，也能促进提取效 果有机溶剂提取： 有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的但一些和脂结合较牢或 分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例 的有机溶剂提取从一些粒线体（Mitochondria）及微粒体（Microsome）等含多量脂 质物质中提取蛋白质时，采用Morton的丁醇法效果较好因丁醇使蛋白质的 变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解 10%，因此具有脂质与水 之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的 再结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。
丁醇提取法的 pH 及温度选择范围 较广（pH3〜10，温度-2C至40C）国内用该法曾成功地提取了琥珀酸脱氢酶 108 - 蛋白质提取与制备 Protein Extraction and Preparation丁醇法对提取碱性磷酸脂酶效果也是十分显着的胰岛素既能溶于稀酸、稀碱 又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中以 60—70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面 可抑制蛋白质水解酶对胰岛素的破坏，同时也达到大量除去杂蛋白的目的表面活性剂的利用： 对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，也有采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷 基磺酸钠等处理表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐 等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（Triton X-100、TirtonX-114、吐温60及吐温80）等非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起 酶失活，使用较多对于膜结构上的脂蛋白和结构，己广泛采用胆酸盐处理， 两者形成复合物，并带上净电荷，由于电荷再排斥作用使膜破裂近年来研究膜 蛋白使用表面活性剂的稀溶液提取时，较喜欢用非离子型表面活性剂 对提取物的保护：在各种细胞中普遍存在着蛋白水解酶，提取时要注意防止由它引起的水解。
前面所讲的降低提取温度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解多数蛋白水 解酶的最适PH在3〜5或更高些，因在较低PH条件下可降低蛋白质水解酶引起 的破坏程度低pH可使许多酶的酶原在提取过程中不致激活而保留在酶原状 态， 不表现水解活力加蛋白质水解酶的抑制剂也同样起保护作用，如以丝氨酸为 活性中心的酶加二异丙基氟磷酸，以巯基为中心的酶加对氯汞苯甲酸等提取溶 液中加有机溶剂时也能产生相类似的作用蛋白水解酶的性质变化很大，上述条 件均视具体对象而变化 有一些蛋白含巯基，这些巯基可能是活性所必需在提取这种蛋白不要带入 金属离子和氧化剂前者可往提取液中加金属螯合剂如EDTA，后者可加入还 原 剂如抗坏血酸有某些蛋白质带一些非共价键结合的配基提取时要注意保 护，不要使酸基丢失3．操作步骤(1) 单层细胞的培养，用室温 PBS 洗细胞一次，然后甩干；悬浮培养的细胞， 400g离心lOmin，收集细胞弃上清液2) 对于单层细胞培养，将培养瓶置于冰上，每100mm培养瓶加入1 mL溶解缓 冲液(。