实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化【实验目的】熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.2〜0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞, 600细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状 态的细胞称为感受态细胞（competent cells）此时，若在感受态细胞中加入质粒，则质粒 DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42°C短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形 成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上 的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细 菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能器材与试剂】1．实验仪器 培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22p m滤膜），酒精灯2. 实验试剂 氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH， 氨苄青霉素钠，琼脂粉，lB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，800 mL 蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0,蒸馏水定容至1 000 mL，121C高压灭菌20 min； LB固体培养基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0,蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121C高压灭菌20min， 分别倒入无菌培养皿。
若配制选择性培养基，当温度降至60C左右时，加入1 mL氨苄青霉 素溶液（100mg/mL）,混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g, 用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL, 121C高压灭菌20 min, 4C保存；氨苄青霉素钠溶液: 准确称取氨苄青霉素钠0.5 g,用蒸馏水溶解并定容至5 mL,用微孔滤器过滤除菌后，分装 于Eppendorf管中，-20C保存3. 实验材料 E.coli DH5a ,PetT5b 质粒【实验步骤】1 •接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中，37C振荡（约250r/min）培养过夜2.将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37C继续 振荡培养至OD600约为0.2〜0.4 （约2 h）3. 取1 mL培养物于一灭菌的Eppendorf管中，冰浴放置10〜30 min, 4°C, lOOOOrpm离心30 秒，弃上清4. 沉淀用0.2 mL冰冷氯化钙溶液轻轻悬浮，冰浴放置15 min, 4C, 10000rpm离心30秒, 弃上清5. 沉淀再用0.2 mL氯化钙溶液轻轻悬浮，放置在冰浴中，制成大肠杆菌感受态细胞。
6. 取5卩L p-ET15b质粒(不超过10 ng),加入制好的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min7. 42 C热激90 s后，迅速置于冰浴5 min8. 加入800 gL培养基，37 C振荡(100 r/min)温育1 h，使Pet-15b上的氨苄青霉素抗性 基因得以表达9. 取200 gL涂布于含氨苄青霉素钠(100 gg/mL)的LB固体培养基上，正向放入37C培养 箱中培养1 h,再倒置培养过夜至菌落清晰，统计菌落数量注意事项】1. 应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞，060(最好不超过0.42. 整个实验最好在低温环境下进行，以获得较高的转化效率3. 每次悬浮沉淀细胞要轻缓，避免剧烈振荡实验作业】根据质粒的用量，计算本实验制备感受态的转化率(cfu/gg DNA)参考文献1. 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社， 1993. 287~2892. 刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社， 2002. 22~253. Cohen SN, Chang ACY, Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic transformation of Escherichia coblyiR-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1972,69:21104. 魏群.分子生物学实验指导.北京：高等教育出版社， 1999.53〜55。