第一章 绪论1.生物技术的定义与内容生物技术是指应用自然科学和工程学的原理，依靠生物作用剂的作用将物料进行加工以提供产品或为社会服务的技术生物技术内容：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等生物技术的一个主要目标就是生物物质的高效生产2.什么是生物药物？生物药物可分为哪些类型？生物药物：利用生物体的初级或次级代谢产物、生物组织或整个生物体来生产用于预防、诊断或治疗疾病的医用品生物药物的分类（按来源与性质分类）1. 天然生物药物：天然存在于动物、植物、微生物以及各种海洋生物等生物体内，直接通过提取、分离和纯化获得的有效的药理成分；2. 重组药物：重组多肽、蛋白质3. 基因药物：核酸类药物（基因治疗剂、基因疫苗、反义药物等）4. 合成与半合成的生物药物生物药物按功能与用途划分为：1. 治疗药物 2. 预防药物（主要预防传染病，疫苗、类毒素）3. 诊断药物（速度快、灵敏度高、特异性强）3. 了解和熟悉一些常见的基因工程肽类药物细胞因子（cytokine）：细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白质的统称在很多情况下，多种免疫细胞间的相互作用是通过细胞因子介导完成的干扰素类(interferon，IFN)，白细胞介素类（interleukin，IL），集落刺激因子类（colony-stimulating facor, CSF)，表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF），神经生长因子（nerve growth factor，NGF ），肿瘤坏死因子类（tumor necrosis factor，TNF），红细胞生成素（erythropoietin，EPO），凝血因子VIII、IX。
激素:胰岛素(insulin)，生长激素（growth，GH），降钙素（calcitonin ），心钠素（atrial natriuretic factor, ANF ）药用酶及其他蛋白药物：链激酶（streptokinase,SK），尿激酶（urokinase），葡激酶（staphylokinase），组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，t-PA ），超氧化物岐化酶（superoxide dismutases，SOD）第二章 基因工程制药1、写出基因工程的基本要素及制备基因工程药物的基本过程基因工程基本要素：工具酶，目的基因，载体，宿主制备基因工程药物的基本过程2、列出4种获取目的基因的方式1、构建基因文库适合于无内含子的原核生物2、构建cDNA文库适合于真核生物基因克隆3、PCR方式4、化学合成已知基因或蛋白质全长序列，合成短的寡核苷酸片断，拼接为长的DNA片断，再用连接酶连接成完整基因3、了解常用的外源基因表达系统1、原核表达体系（1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系2）枯草芽孢杆菌（3）链霉菌2、真核表达系统（1）酵母（2）丝状真菌。
近年来在30种以上丝状真菌中建立了DNA转化体系3）昆虫细胞表达体系以昆虫细胞为表达宿主4）哺乳动物细胞表达系统4、写出大肠杆菌表达系统的优势和缺点大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系革兰氏阴性菌优势：遗传背景清楚，基因组序列已确定；生长迅速，平均20~30min繁殖一代；易于培养，生产成本低，适合大规模培养；外源基因表达水平高，可达总蛋白的5~30％以上；有大量可供选择利用的克隆和高效表达载体缺点：缺乏翻译后加工修饰系统，缺少糖基化功能；没有有效释放蛋白到培养基中的分泌机制；表达的外源蛋白多形成包涵体，蛋白的复性较困难；翻译目的蛋白N端常多一个甲硫氨酸残基（AUG编码）5、写出融合表达优点和缺点融合表达具有多方面的优点：1、能使外源基因得到有效转译，防止包涵体的形成，促进蛋白质的正确折叠，限制蛋白酶解，利于检测与纯化2、成功应用的融合担体蛋白：谷胱甘肽S-转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）以及硫氧还蛋白（Trx）等3、融合表达一般都有方便的纯化方法（ GST 融合蛋白可采用谷胱甘肽-sepharose亲和柱进行纯化，带组氨酸标签的融合蛋白采用金属螯合层析纯化）缺点：对融合蛋白进行位点特异性裂解。
6、质粒不稳定有哪两类？1、分裂不稳定性：工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌相关因素：（1）质粒的丢失率（宿主菌、质粒特性和培养条件）；（2）含质粒菌与不含质粒菌的生长速度差异2、结构不稳定：DNA从质粒上丢失、质粒上序列发生重排等7、画出基因工程药物分离纯化的流程8、什么是包含体？包含体形成的原因是什么？包含体表达的优点和缺点是什么？常用哪些试剂溶解包含体？包含体复性的方式有哪些？包含体（Inclusion Body）：外源基因在大肠杆菌中高水平表达时通常形成的一种由目的蛋白构成的不溶的、无活性的蛋白聚集体包含体表达的优点：表达量高；密度高（1.2-1.4g/mL之间 ），容易分离；抗蛋白酶；对宿主毒性小包含体复性方法：稀释复性；透析复性；层析复性影响复性的操作参数：蛋白浓度、温度、pH、离子强度提高蛋白复性率的策略：复性添加剂如PEG、表面活性剂；分子伴侣常用半胱氨酸之间形成二硫键方法：1. 空气氧化法在碱性条件下通空气，氧化时可以加入二价铜离子加快反应速度，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势，而且二硫键的氧化形成速度慢；2.氧化还原对重排体系常用氧化还原对有氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸，通过调整氧化还原两种物质的比例可以控制较精确的氧化还原电势，对二硫键反应进行控制，其二硫键形成速率快于空气氧化法。
9、对基因工程药物进行质量控制时需要做哪些项目分析？目标产品的质量控制：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性、一致性1.生物活性测定：活性、比活2.产品的鉴定（1）相对分子量：SDS-PAGE、凝胶过滤，允许10%误差必要时采用质谱准确测定2）等电点：等电聚焦测定，等电点常不均一，每批测定结果应一致3）紫外吸收光谱：特征型吸收，每批一致（4）氨基酸序列测定：送检中试头三批产品，N端15个氨基酸序列，C端1～3个氨基酸残基5）氨基酸组成分析（6）免疫印迹（western blot）（7）圆二色光谱（8）肽图：一般用胰蛋白酶或CNBr裂解，再用RP-HPLC或SDS-PAGE分析（9）二硫键分析3.蛋白纯度分析：必须采用非还原SDS-PAGE和HPLC进行检定，其他检测方法包括CE（毛细管电泳）等4.杂质检测（1）内毒素：家兔法、鲎试剂法（2）宿主细胞蛋白：免疫分析（3）宿主细胞残余DNA：核酸杂交，100pg/剂量（4）细菌、酵母、真菌、支原体、病毒：微生物学方法（5）其他物质：抗生素，牛血清；采用了抗体亲和层析，检测小鼠IgG含量5.稳定性检测：在不同温度下保存，定期取样检测生物活性及其他特性的变化。
6.一致性：各批次产品均符合标准规格第三章 动物细胞工程制药1、动物细胞可应用于哪些药物的生产？动物细胞作为一种重要的宿主细胞，可用以下药物的生产：病毒、疫苗、其他的各种重组蛋白、单克隆抗体2、请根据哺乳动物的形态对其进行分类离体培养的动物细胞主要为哺乳动物细胞根据是否需要帖附于支持物上生长的性质，可将动物细胞分为贴壁依赖型和悬浮型两类1、贴壁依赖型绝大多数细胞在培养时必须贴附在某一固相表面才能生存和生长 按培养细胞的贴壁的形态主要分为4类：（1）成纤维细胞型形状与体内成纤维细胞形状相似而得名，细胞大致呈梭形或不规则三角形2）上皮细胞型形状为扁平的不规则多角型3）游走细胞型在支持物上分散生长，不连接成片，呈活跃的游走和变形运动4）多形性细胞形态不规则2、悬浮型少数细胞在培养时呈悬浮生长，来源于血液、淋巴组织的细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞为悬浮型形态常为球形，可悬浮培养3、兼性贴壁细胞不严格的依赖支持物，某些情况下可在培养基中良好悬浮生长3、写出动物细胞的生理特征动物细胞的生理特征:1. 细胞分裂周期长（ 12~48h ） 2. 细胞生长需贴附基质，存在接触抑制3. 正常二倍体细胞生长寿命有限4. 对周围环境十分敏感5. 对培养基要求高：氨基酸、维生素、无机盐、细胞生长因子、贴壁因子、血清等。
6. 对蛋白合成途径和修饰与细菌不同（糖基化）4、简要了解生产用动物细胞的种类及细胞库的类型动物细胞种类：1原代细胞：直接取自动物组织、器官，经粉碎、消化得到的细胞悬液特点：需要大量动物，例：鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、血液淋巴细胞2. 二倍体细胞系：通过筛选、克隆从原代培养细胞中获得的具有某种特征的有限细胞株特点：有限增殖、2n、贴壁、接触抑制例：MRC-5、WI-383、转化细胞系：通过某个转化过程形成， 常由于染色体断裂成为异倍体特点：自发形成，啮齿动物细胞多发；病毒感染后转化；直接从动物肿瘤组织中建立的细胞系转化细胞具有无限生命力，一般倍增时间短、对培养条件和生长因子要求较低4、融合细胞系：细胞融合：两个或两个细胞合并成一个细胞的过程主要为杂交瘤细胞5、重组工程细胞系：构建含目的基因的真核细胞表达载体（病毒载体、质粒载体）导入动物细胞，通过选择标记筛选工程细胞细胞库类型：1、原始细胞库（master cell bank，MCB）：二倍体细胞：群体倍增水平尽可能低的细胞（传代次数尽可能少的细胞），记录详细档案2、工作细胞库（working cell bank，WCB）：生产用细胞库（manufacturer’s working cell bank，MWCB）5、动物细胞培养所用合成培养基主要成分包括哪些？培养基中添加血清的作用是什么？合成培养基成分明确、组分稳定，主要由成分包括：1、氨基酸 必需氨基酸、半胱氨酸、酪氨酸及其他种类氨基酸；2、维生素3、能源物质（葡萄糖、谷氨酰胺）4、无机盐5、缓冲体系6、其他成分 如核酸前体物质（腺苷、鸟苷等）、脂类物质等血清作用：1、提供细胞生长所需的各种生长因子和激素2、提供细胞生长所需的贴附因子和伸展因子3、提供可识别金属离子、激素、维生素、脂质的结合蛋白4、提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素。
6、动物细胞培养采用无血清培养基有何优点？无血清培养基中需要在合成培养基的基础上加入哪些成分？无血清培养基的优点：提高了细胞培养的重现性、减少了血清带来的污染问题、供应充足、产品易于纯化在合成培养基中添加一些特殊成分而成：1、激素和生长因子 (胰岛素和表皮生长因子等)2、结合蛋白（铁传递蛋白、白蛋白）3、帖附和伸展因子（纤维结合蛋白胶原、一些多肽）4、其他有利于细胞生长的因子和元素（谷胱甘肽、硒等）7、了解动物细胞大规模培养的培养方法动物细胞大规模培养方法：1、悬浮培养：适用于非贴壁依赖性细胞，如杂交瘤细胞适应于兼性贴壁细胞2、贴壁培养：细胞贴附在固体表面生长以单层膜的形式生长，适用于贴壁依赖性细胞与兼性贴壁细胞3、假悬浮培养（微载体培养、微囊化培养）：微载体培养指将细胞贴附在微载体上进行悬浮培养微囊化培养指将动物细胞包裹在亲水的球状半透性薄膜形成的微囊内营养成分能透过，但细胞不能出来适用于贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞包埋培养采用各种凝胶进行包埋后培养。