单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程克隆方案设计,基因工程实验设计,1、目的基因的序列分析,2、载体的选择和分析,3、克隆策略的设计,4、引物的设计,目的基因的序列分析,1、分析 ORF：,找到需要克隆的核酸序列,2、分析酶切位点：,（1）酶切位点为0的酶；可通过引物加入，方便克隆；,（2）酶切位点为1和2的酶：用于酶切克隆或基因和重组质粒的酶切分析载体的选择和分析,1、根据目的选择合适的载体质粒：克隆、表达或其它用途2、MCS(多克隆位点）是否有合适酶切位点（一般是基因上没有或1个的酶切位点),3、表达载体，要注意表达框架配对4、载体的酶切位点，用于重组鉴定克隆策略的设计,1、平端克隆；,2、粘端克隆,（1）,TA克隆,（2）单酶切不定向克隆,（3）,双酶切定向克隆,平端克隆,机械打断，化学合成，,Eco,R V酶切，或其它酶切位点末端改造（klenow 酶补平，S1处理）产生平端；,克隆效率较低，ligase 要加大量；,载体需脱磷；,方向可正可反TA克隆,1、普通Taq酶扩增的PCR产物3末端会多加一个A;,2、公司提供的T-vector的5末端有一个粘性的T;,用途:,(1)PCR产物快速克隆：,（2）基因测序（可正可反）；,（3）利用T-vector上的MCS,为下一步克隆调整酶切位点,单酶切不定向克隆,载体需要脱磷（否则，自连效率极高，外源基因无法插入）；,基因插入可正可反，需要筛选。
双酶切定向克隆,类型,：,（1）,粘-粘连接,：最有效、最快捷,（2）,粘-平连接,：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平,特点,:,(1)基因和载体都用两种酶切割；,(2)连接效率高；,(3)外源基因插入方向固定，不用鉴定定向克隆的,注意点,：,（1）两个同尾酶切出的末端一样，相当于单酶切不定向克隆；,（2)载体MCS中的两个酶切位点要远一点，防止一端没切透；（可选用中间插入其它基因片断的载体酶切回收制备）引物的设计,常规设计原则,特殊用途设计技巧,引物常规设计原则,1.长度：7 nt,一般nt左右;(仅binding,不含接头),2.G+C 含量,3.避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；,4.引物自身不能互补（3个）,5.引物之间不能互补（5个）,6.引物端不能错配,不能修饰，尽量不用A,不能超过个连续的G或C；,7.端可变化修饰，附加酶切位点；,8.两引物的Tm值应比较接近；,9.正链引物：mRNA序列照抄；,负链引物：先写出mRNA序列的互补序列，然后翻转重写解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T)=20nt,Tm一般最佳,PCR反应中结合温度（anneaning temperature）T=Tm-5,特殊用途引物设计技巧,1.5附加酶切位点(,定向克隆,),:,2.引入点突变,3.有不确定序列,4.PCR产物直接测序,5附加酶切位点(,定向克隆,),1、不同酶的保护碱基序列不同；NEB catalog提供相关资料。
2、有些酶的保护碱基包含其它酶切位点，注意双酶切的先后顺序:,Nde,1,Eco,R1,引入点突变,1.一条引物最多引入3个点突变,可延长引物长度.,2.突变位点要靠近5端.,3.要注意密码子的偏好性,简并性,有不确定序列（34种）,5,ATG GGC,I,CC A,I,A,I,CT TCT ACC,3,说明：1、次黄嘌呤核苷酸,I,可与四种碱基配对；,2、可用于PCR产物直接测序有不确定序列（2种）,5,ATG GGC,A,CC A,T,A,G,CT TCT A,(A/C),C,3,说明：,1,表示该位点有两种可能的序列A或C;,2.合成引物时只要一条引物的money;实际得到的是两条引物等比例的混合物：,5,ATG GGC,A,CC A,T,A,G,CT TCT A,A,C,3,5,ATG GGC,A,CC A,T,A,G,CT TCT A,C,C,3,3、设计时可靠近 3 端,4、不能用于PCR产物直接测序,。