植物基因组提取(CATB法)来源:生物时间：2007-3-27 21:34:00浏览人数：2208一、 实验目的掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物 总DNA抽提方法二、 实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是 氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如 巯基乙醇)以降低这些酶类的活性在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种 酶类的作用十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide， 简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂， 能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来再加入苯酚和氯仿 等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸DNA、RNA)水溶性很强，经离心 后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉 淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
三、 实验材料水稻幼叶四、 主要试剂配方2% CTAB 抽提缓冲溶液：CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解，再定容至200ml灭菌，冷却后 0.2-1% 2-巯基乙醇(400ul)氯仿-异戊醇(24： 1):先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可五、实验步骤1. DNA的提取(1) 2%CTAB抽提缓冲液在65°C水浴中预热2) 取少量叶片(约1g)置于研钵中，用液氮磨至粉状；(3) 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；(4) 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；(5) 置于65C的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；(6) 冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇(24： 1)至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合 均匀；(7) 放入离心机中10 000 rpm离心10 min,与此同时，将600 µl的异丙醇加入另 一新的灭菌离心管中；(8) 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内, 将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；(9) 10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管 倒立于铺开的纸巾上；(10) 60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸 钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；(11) 放置30 min,使DNA块状物的不纯物溶解；(12) 10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再 洗 30 min；(13) 10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟 后，直立离心管，干燥DNA (自然风干或用风筒吹干)；(14) 加入50 µl 0.5 x TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37°C恒温箱约15 h,使RNA消解；(15) 置于-20 C保存、备用。
2. DNA质量检测琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二六、注意事项(1) 叶片磨得越细越好2) 移液器的使用3) 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性 外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。