光学显微镜的原理和应用简介一、光学显微镜发展历史与最新进展 已近 400 年的历史十九世纪之前发展非常缓慢1665年：英国物理学家R・Hoock的第一台显微镜的雏形 十八世纪初：慧更斯目镜的发明十九世纪中： Lister 和 Amici 制造了消色差物镜，部分消除了色差，后者首次制成水浸物镜， 使数值孔径NA11886 年: Ernst Abbe与Carl Zeiss第一个生产出了复消色差物镜，消除了球差和色差的干 扰，提高了数值孔径(1・4)，并奠定了现 代光学理论原理1893年： August Koler教授发明了著名的柯勒照明1890-1899年：金相显微镜、消像散透镜和双筒目镜以及第一台体视显微镜 的诞生二十世纪初：出现了齐焦物镜 1932 年底： 诞生了透射电子显微镜，电子显微镜的分辨率是传统光学显微镜的 1000倍以 上1930－1940年：显微分光光度计的出现，预示着显微定量技术的开始1940－1950年：出现了荧光显微镜二次大战之前： Zeiss 公司基于诺贝尔奖获得者荷兰物理学家 Frits Zernike 的光学理论制 造了第一台观察活细胞的相差显微镜1955年： 物理学家Georges Nomarski改良了 Wollaston棱镜，诞生了另外一种增强活细胞反差技术的显微镜一 Nomarski干涉显微镜即微分干涉差显微镜。
1975年：Robert Hoffman又提出了一种增强活细胞反差的技术，即Hoffman调制相差显 微镜1970一80 年：医学图像处理与分析系统1970一80 年：流式细胞仪1980一90年：诞生了激光扫描共焦显微镜比普通光学 显微镜的分辨率提高了 1・5倍80年代末和90年代初：诞生了双光子扫描显微镜二十世纪90年代末~至今：全内反射显微镜，物镜数值孔径达到了 1・6分辨率：普通光学显微镜：xy- 0.25 gm共焦显微镜：xy- 0.18 gm, z- 300nm全内反射显微镜 ： z- 100nm4pi： zv100nmSTED： xy- 20nm透射电镜： xy- 0.1nm二、生物光学显微镜主要种类：眀场透射光显微镜: 观察经过组化染色的标本暗视野显微镜：适于观察未染色的标本一活细胞 散射光成像 相差显微镜： 适于观察活细胞光相位差转换成振幅 差微分干涉差显微镜: 适于观察活细胞利用双束偏振光的干涉增强反差 荧光显微镜： 观察标记了荧光探针的样品（活细胞或 固定样品） 偏振光显微镜： 利用偏振光观察晶体结构或具有双折射性的结构，如 : 细胞骨架、纤 维、 膜Hoffman 调制相差显微镜：观察活细胞三、光学显微镜的基本组成 光学显微镜主要由光学成像部分和机械结构部分组成。
光学成像：物镜、目镜、照明系统、滤片系统 机械结构：镜座、镜臂、载物台、镜筒、 物镜转换器、调焦装置光学成像部分：（一）物镜1．组成和作用：由凹凸透镜组成，直接使样品成放大倒立 的实像（放大 1 100 倍）物镜 品质的好坏、档次的不同决定了整个显微镜的质 量2．分类1）按介质不同分类： 干燥物镜（简称：干镜）（空气 n=1） 油浸物镜（简称：油镜）（油 n=1.515） 水浸物镜（简称：水镜）（水 n=1.333）2）按校正像差分类：消色差物镜（achromatic objective） 平场消色差物镜（ plan objective） 平场半复消色差物镜（plan fluotar objective） 平场复消色差物镜（ plan apochromatic objective）3）按工作距离分类 长工作距离物镜 普通工作距离物镜4）按功能分类相差物镜偏振光物镜 微分干涉差物镜5）按镜筒长度分类 有限远物镜 无限远物镜（二）目镜组成和作用：由凹凸透镜组成，将物镜形成的倒立 实像放大为 10-16倍的虚像按目镜视场数可分为：非广角目镜、广角目镜、 超广角目镜等对于10 X目镜而言，视场数＜18mm,常称为非广角目镜。
视场数M 18mm,常称为广角目镜视场数＞20mm,常称为超广角目镜三）照明系统1．视场光阑2．聚光器3．光源1. 视场光阑 视场光阑常位于支架底座上，其光阑大小能连续改变，它通过聚光镜能清晰地成 像在标本面上所以在目镜中看清标本的同时也能看到视场光阑多边形或圆形图像可变 视场光阑的像应外切于目镜中的视场光阑，使光线只能照明需观察的标本，尽可能减少标 本四周的散射光2．聚光镜（器）组成和作用： 由前端透镜、可变孔径光阑组成作用是改变入射光的强度，调节光束大小，使光源 发出的光线形成一束与物镜数值孔径大小相适应的光束，达到均匀照明标本的目的可变孔径光阑 可变孔径光阑是聚光镜中非常重要的装置，由于各个物镜的数值孔径不同， 要求照明光束的孔径角也相应的变化,因此,，聚光镜中必定有一个能连续改变照明孔径角的可变光阑 此光阑即为可变孔径光阑3．光源1） 照明光源：天然 ：阳光人工 ：卤素灯、高压汞灯、氙灯2） 照明方式：分透射照明和落射照明简介I） 透射照明：光源来自标本下方，透过样本到达物 镜，透射照明光源通常采用卤素灯 目前最常见的透射照明方式：柯勒照明II） 落射照明：光束通过物镜落射到标本上，物镜收集反射光，进而成像。
物镜本身又作为聚光镜主要用于荧光显微镜、反射光显微镜和偏光显微镜通常荧光显微镜采用 高压汞灯或氙灯 作为光源四）、滤片系统1．普通滤片分三类： 日光型滤片：用于矫正色温，把显微镜灯光的色温转变为（DFL） 阳光的色温，使彩色照片颜色还原正确中性滤片：使光源的光减弱，对波长无选择性，也不改变（ N4） 色温 补偿滤片：如染色为红色可选用绿色滤片增加反差GREEN）2．荧光滤片详见第四节（荧光显微镜）第一节 透射光显微镜一、光路结构与原理第一节 透射光显微镜1．成像：物体在物镜后方形成倒立放大实像（此像在目镜焦点以内）通过目镜形成倒立放大虚像(此像在眼睛明视野25cm以内)通过晶状体在视网膜上成为正立的像2．焦点： 凸凹透镜焦点，凸为实焦点，凹为虚焦点3. 透镜成像的基本特性-平行于光轴的入射光通过透镜的焦点出射 -通过焦点的入射光平行于透镜的光轴出射通过透镜轴心的入射光出射方向不变4. 有限远光路特点：1) 物体位于物镜前焦点之外2) 非平行光路3) 镜筒长度：物镜后焦面至目镜前焦面的距离 (160mm)5.无限远校正显微镜光路(Zeiss,1824年提出；1980年后应用)特点：1) 物体位于物镜的前焦平面上2) 为平行光路3) 具有镜筒透镜二 物镜的性能1 •数值孑・径(numeric aperture NA)数值孔径是物镜最重要的参数之一， 它直接影响物镜的分辨率和物镜的光亮度。
NA=nx Sin un：物镜与样品之间介质的折射率u： 1/2孔径角，进入物镜口边缘入射光束与物镜光轴之间的夹角增大u和n,可以增大NA干燥物镜：介质为空气n= 1NA： 0.05 〜0・95水浸物镜：介质为水n « 1.33NA： 0.7〜1.25油浸物镜：介质为镜油(香柏油)n « 1.5NA： 0.85〜1.4工作距离：物镜前透镜与样品之间的距离为工作距离 距离越短，u越大，NA越大通常物镜的最大数值孔径为1.4,但现在有一种特殊物镜，其数值孔径可达1・6,这类物镜 用于全内反射显微镜2.分辨率(resolution power R)区分物平面两个点间最小距离为分辨距离即分辨率，它代表分辨微细结构的本领R = 0.61 九 / NA (R=0.61/ 2 NA)入:光波波长(通常入=550nm)NA ：物镜数值孔径若，NA=1.4，波长九：550nm贝 U R= 0.61X 0.55/1.4=0.24p0.25 p是光学显微镜的极限分辨率数值孔径越大，波长越短，分辨率 数值越小，而显微镜分辨能力越高AI= 26.4% d=0 ・61 九 / NA光学极限分辨率是由光的衍射特性决定的3. 放大率(magnification M)放大率(M)幽镜放大率(MJ X目镜放大率(M2)物镜放大率：Mj=A / Fj有限远光路：A：镜筒长度，物镜后焦面至目镜前焦面的 距离(160mm)。
Fj物镜焦距无限远光路： A： 镜筒透镜的焦距目镜放大率： M2= 250 / F2250mm：眼到物的明视距离f2：目镜焦距M2的放大率不超过16倍4. 景深－焦点深度( focal depth) DF景深表示清晰的像平面所能对应物平面前后空间的深度；或指焦点与样品上某点 相一致时，能看清这一点及其上下两侧的结构，那麽，清晰部分的厚度即景深，也称之为 焦点深度Df= 1/7NA*M +A /2NA2式中：DF ：景深NA : 数值孔径 NAM ：总放大率入：光波波长，单位:mm注：放大倍数越大，数值孔径越大，显微镜景深越小5•镜像亮度(light of image, L)镜像亮度与数值孔径的平方呈正比，与总放大率的平方呈反比L = NA2/ M2,M2 =(叫 x M2)2V N -注意：在同一放大率下选用不同数值孔径的物镜，其镜像亮度不同数值孔径越高，镜 像亮度越高数值孔径相同或相差不大的情况下，物镜倍率越高，镜像亮度越暗这一点 在观察荧光样品时尤其要注意，应权衡选用适当的物镜NA对荧光图像的亮度尤其重要6. 物镜工作距离物镜工作距离越长，NA越小Confocal 中要观察厚的样品时，在相同倍率下，数值孔径接近的情况下，应选择工作距离长的物镜来观察。
63x/1.32 oil L: 0.07mm63x/1. 2 w L: 0.22mm聚光镜 组成和作用： 由前端透镜、可变孔径光阑组成作用是改变入射光的强度，调节光束大小，使光源 发出的光线形成一束与物镜数值孔径相适应的光束，达到均匀照明标本的目的 可变孔径光阑可变孔径光阑是聚光镜中非常重要的装置，由于各个物镜的数值孔径不同 ,要求照明光 束的孔径角也相应的变化,因此,聚光镜中必定有一个能连续改变照明孔径角的可变光阑，此 光阑即为可变孔径光阑聚光镜分为干、湿两种所谓“湿”即使用时需滴上浸液这类聚光镜NA为1.2〜1.4干”使用时不需滴浸 液,NA常为0・9徕卡还备有干、湿两用的聚光镜，NA 0.9/NA 1・25数值孔径为 0.9的聚光镜与孔径为 1.25的 100倍油镜配合使用,其分辨率不会降低 因为可变孔径光阑的大小可以为物镜数值孔径的2/3 3/4，即1・25*3/4=0.94,NA0.9干聚光镜 正好与之相适应,也免去操作者滴油及清洁的麻烦对于特别追求鉴别率的场合 ,则应采用湿聚光镜,使用时,应在载玻片与聚光镜上表 面滴上相应的浸液柯勒照明：是一种较为完善的照明方式，目的是得到最好的 反差和最清晰的图像。
严格的柯勒照明必须符合 下面三个条件：－照明均匀，灯丝像位于聚光镜的前焦面上，通过聚光镜以平行光束照明标本－孔径光阑大小可任意改变，以适应不同倍率物镜的需要 －具有可变的视场光阑，以适应不同倍率物镜的不同照明范围需要第二节 物镜的分类和标识一、物镜的分类（一）按像差校正程度分类： 1．消。