Folin—酚试剂法（ Lowry 法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度这两种显色反应产生深兰色的原因是：? 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物Folin — 酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤以后在生物化学领域得到广泛的应用 这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应而且对后者的影响还要大得多酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用浓度较低的尿素 （ 0.5% ） ， 硫酸纳（1% ） ，硝酸纳（ 1% ） ，三氯乙酸（0.5% ） ，乙醇（ 5% ） ，乙醚（ 5%） ，丙酮（ 0.5% ）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。
含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2 倍进行测定时，加F olin —酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH 条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生， 故当 Folin 一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时， 必须 立即混匀 ，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定此法可检测的最低蛋白质量达5mg 通常测定范围是20~250mg二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A） 10 克Na2CO3， 2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸钾钠（ KNaC4H4O6·4H2O） 溶解于500毫升蒸馏水中B） 0.5 克硫酸铜（ CuSO4 ·5H2O ）溶解于 100 毫升蒸馏水中，每次使用前，将50 份（ A）与1 份（ B）混合，即为试剂甲2）试剂乙：在 2 升磨口回流瓶中，加入100 克钨酸钠（Na2WO4·2H2O ）,25 克钼酸钠（ Na2MoO4·2H2O）及 700 毫升蒸馏水，再加50 毫升 85% 磷酸， 100 毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流 10 小时，回流结束时，加入150 克 硫 酸 锂（ Li2SO4 ） ，50 毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15 分钟，以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤） 稀释至1 升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存使用时用标准NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1 倍，使最终的酸浓度为1N 左右3）标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管 16 支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取 16 支大试管， 1 支作空白， 3 支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1 ，0.2，0.4，0.6 ，0.8 ，1.0 毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml） 用水补足到1.0 毫升然后每支试管加入 5 毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10 分钟再逐管加入 0.5 毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱然后在室温下放置30 分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
注意：因Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1 支试管加入 5 毫升试剂甲后，开始计时，1 分钟后，第2 支试管加入5 毫升试剂甲， 2 分钟后加第3 支试管，余此类推全部试管加完试剂甲后若已超过10 分钟，则第1 支试管可立即加入0.5 毫升试剂乙， 1 分钟后第2 支试管加入0.5 毫升试剂乙，2 分钟后加第3 支试管，余此类推待最后一支试管加完试剂后，再放置30 分钟，然后开始测定光吸收每分钟测一个样品进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值Folin—酚试剂法实验表格：管号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10标准蛋白质0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml ）未知蛋白质0.2 0.4 0.6（约 250mg/ml）蒸馏水1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（ug）吸光度值（ A700 ）2. 样品的测定：取1 毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1 毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。
通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3 个试管如上表中的8、9、 10 试管根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）lowry 法又称为Folin－酚试剂法操作步骤：1 溶液 A，100ml0.5gCuSO4 （5H2O）1gNa3C6H5O7(2H2O)加双蒸水至100ml ，溶液可长期保存于室温2 溶液 B， 1L20g 碳酸钠4g 氢氧化钠加双蒸水至1L 溶液可长期保存于室温3 溶液 C， 51ml1ml 溶液 A50ml 溶液 B4 溶液 D,20ml10mlFolin －酚试剂10ml 双蒸水检测步骤： 1，用双蒸水稀释样品至0.5ml2，加 2.5ml 溶液 C3,混匀在室温下放置5～10min4,加 0.25ml 溶液 D，混匀5, 20 ～ 30min 后，在分光光度计上测A750 1 第一步后的10 分钟很重要，不是说一定要10min ，而是说不同样品的反应时间应控制一致。
因为该步反应会随时间进行，直到加入第二个溶液后才停止反应2 第二步反应，在30 分钟到 1 个小时内基本是稳定的在 560nm 处检测的是Lowary 的 改进法， 用 4-甲酸喹啉代替Folin 试剂，在碱性条件下，蛋白质与Cu2+反应形成Cu+与 4-甲酸喹啉反应生成紫色络合物，在560nm 测定该试剂比Lowary 的试剂稳定，干扰大大减少，而灵敏度相近如果是问的lowry 法（又称Folin —酚法）测定蛋白质含量的话，那就只有700nm了此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度这种方法的原理是在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物 Folin —酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比除了这种方法以外我们目前常用的蛋白质含量测定方法还有Bradford法，595nm 检测Bicinchoninic acid (BCA ) 法是近来广为应用的蛋白定量方法其原理与Lowery 法蛋白定量相似，在 562 nM 处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。
与Lowery法相比， BCA 蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小与Bradford 法相比， BCA 法的显著优点是不受去垢剂的影响 药典对 lowry法有详细的说明，使用的波长是650nm ，在三部药典附录VI B 上写得十分明确事实上， folin- 酚法的检测波长是相当宽泛的，可以在500nm到 750nm任意选取，选取不同的波长的灵敏度不一样，检测的蛋白量也不一样一般的选择的波长较长，同样蛋白的吸光度较大，也就是说生成的复合物的吸光系数较大因此选择波长只要不受干扰，从 500 到 750 都可以， 一般常用的有500 ，540 ， 640 ，660 ，700 ，750没有固定说法，试实验需要跟各人爱好确定参考资料：生物化学实验原理和方法，北京大学出版社出现负值嘻嘻我今天也是如此，我是测我合成的多肽，测得280 一看吓一跳是负数，我在看看合成的说明书，公司纯化时测波长是210nm 我在测果然就变正常了，所以你查查你的蛋白吸收值应该在哪里，一定是小于你测得设定数，就好了。