1Avermectin B1a 组分高产菌株的诱变育 种作者：任超 马王向坡 李宝库 路新利【关键词】 Avermectin,B1a 组分；,诱变；,效价；,高产菌株摘要： 目的 了解 avermectin 产生菌 S.avermitilis 的生长特性，提高产生菌 B1a组分的产量方法 采用紫外线、诱变剂亚硝基胍并结合甲硫氨酸诱变等手段对出发菌株 S.avermitilis N56 进行诱变处理，初筛、复筛结果 筛选获得总效价达到45258μg/ml 的高产除虫链霉菌突变株 A3，B1a 比例提高到 560%结论 采用紫外线及亚硝基胍诱变方法，结合甲硫氨酸诱变筛选，与出发菌株相比可以获得avermectin 总效价及 B1a 组分显著提高的菌株关键词： Avermectin B1a 组分； 诱变； 效价； 高产菌株ABSTRACT Objective To study the characteristics of avermectin producing strains and improve avermectin B1ayield of Streptomyces avermitilis. Method UV and NTG were used as mutagens to treat the original strain N56 as well as methionine as inducer. Results The highyield avermectin strain A3 with avermectin total titer up to 45258 μg/ml was obtained, the ratio of avermectin B1awas increased to 560%. Conclusion It is an effective method of screening highyield avermectin B1athrough mutation by UV and NTG and induction with methionine.KEY WORDS Avermectin B1a; Mutagenesis; Titer; Highavermectinproducing strainAvermectin 的产生菌是除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)，该菌株是 1975 年日本北里研究所(Kitasato Institute)从日本静岗县地区的一个土壤样品中分离得到的。
研究初期已发现该菌株的发酵液具有很高的驱肠道寄生虫活性，该菌株后被2送到美国 Merck 公司作进一步研究1976 年，美国 Merck 公司的科研人员分离了这组具有驱虫活性的物质，并将其命名为 avermectins［1］Avermectins 是一类结构相似的十六元大环内酯类抗生素，共有 8 个组分，分别命名为A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a 和 B2b其中 A1a、A2a、B1a 和 B2a 为 4 个大量组分，含量在 80%以上；A1b、A2b、B1b 和 B2b 为 4 个小量组分，含量在 20%以下，结构见图 1B1 的杀虫活性最高，毒性最小近年，众多科研工作者通过诱变等手段改造菌种的遗传特性，提高 avermectin 有效组分 B1 比例，大村智等在这方面做了很多贡献［2］Avermectin B1a(大于 80%)和 B1b(小于 20%)混合物阿巴菌素(abamectin)已用于畜牧抗虫和农业上的杀螨及选择性的杀虫剂Avermectins R1 XY R2A1a CH3 CH=CH C2H5A1b CH3 CH=CH CH3A2a CH3 CH2-CH(OH) C2H5A2b CH3 CH2-CH(OH) CH3B1a H CH=CH C2H5B1b H CH=CH CH3B2a H CH2-CH(OH) C2H5B2b H CH2-CH(OH) CH3 图 1 Avermectins 结构图1 材料和仪器1.1 菌种除虫链霉菌 S.avermitilis N56 由河北大学微生物研究所提供；突变株 A3由甲硫氨酸平板筛选获得。
1.2 试剂生理盐水，亚硝基胍(NTG)，磷酸盐缓冲液(pH60)，甲硫氨酸(Met)，丙酮(分析纯)，乙酸乙酯(分析纯)，无水甲醇(色谱纯及分析纯)，GF254 硅胶粉，三氯甲烷(分析纯)，二氯甲烷(分析纯)1.3 培养基斜面和分离培养基(g/L) 可溶性淀粉 10，(NH4)2SO4 25，NaCl 06，MgSO47H2O 12，K2HPO43H2O 30，CaCO3 30，琼脂粉20，pH72～74，用蒸馏水配制种子培养基(g/L) 玉米淀粉 25，花生饼粉 10，黄豆饼粉 80，酵母粉 50，酵母膏 50，玉米浆 40，CoCl26H2O 0003，淀粉酶300025，pH70～72，用自来水配制发酵培养基(g/L) 玉米淀粉 70，花生饼粉 10，黄豆饼粉 80，酵母粉 50，酵母膏 30，玉米浆 22，CoCl26H2O 0003，淀粉酶 00025，pH70～72，用自来水配制1.4 诱变及筛选方法1.4.1 紫外线诱变 取制备好的菌悬液 5ml 移入直径为 90mm 的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，功率 20W，波长 254nm 紫外灯下 30cm处打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为 15、30、45、60 和 75s，可以累积照射，也可分别照射不同时间。
取不同照射时间段的菌悬液 1ml，进行 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 和 10-7 梯度稀释，取 10-3、10-5、和 10-7 浓度的稀释液各01ml 涂布于分离平板上，用黑纸包严，28℃倒置培养 7～9d1.4.2 亚硝基胍(NTG)诱变 用 01mol/L，pH60 的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，使浓度为 108 个/ml，分别用 1、2、3 和 4mg/ml 浓度的 NTG 处理紫外诱变后的突变株单孢子悬液，于 28℃震荡 30min，用生理盐水离心洗涤孢子 3 次，经稀释后涂布于分离平板 28℃倒置培养 7～9d1.4.3 甲硫氨酸(Met)诱变 将不含甲硫氨酸的斜面培养基 20ml 倒入培养皿中，待凝固后倒入 10ml 含有不同浓度的 Met 斜面培养基，终浓度分别为025、050、10mg/ml处理后的孢子悬液稀释后涂布于平板上，28℃倒置培养7～9d［3］，挑取优势单菌落转接于斜面，28℃温箱培养1.5 摇瓶发酵从平板上挑取灰色丰满的单菌落转接于斜面，28℃培养 7～9d，将长出丰富的灰色孢子转接于种子培养液，220r/min，28℃摇床培养 28～30h，接种45%于发酵培养液(250ml 三角瓶，装 50ml 发酵液)，220r/min，28℃摇床培养7～9d，放瓶测定效价。
1.6 效价测定菌丝溶媒萃取 取发酵液 5ml，3000r/min，离心 10min，弃上清加入丙酮 2ml，在旋涡式混合器上振荡 1min，静置 10min，重复 3 次加入乙酸乙酯 3ml，振荡 1min，3000r/min，离心 10min，上清液备用层析法分离纯化 吸取 40μl 上清液点样于 GF254 硅胶板上，然后层析展层剂为：乙酸乙酯∶三氯甲烷∶二氯甲烷∶无水甲醇=9∶9∶2∶1层析后在紫外灯下观察，将斑点处硅胶刮入离心管中，加入 2ml 无水甲醇，在旋涡式混合器上振荡 1min，静置10min 后 3000r/min，离心 10minHPLC 法测定效价 采用 C18 反相柱，流动相为无水甲醇∶水(85∶15)，流速 1ml/min，检测波长 2446nm准确吸取 200μl 样品滤液进样，根据各组分的峰面积，对照标准曲线计算其含量，各组分之和即为总发酵效价2 结果2.1 紫外线诱变经紫外线诱变、培养后，活菌计数，计算诱变后的正突变率及孢子致死率，结果如表 1实验中观察到该菌株对紫外线异常敏感，紫外照射时间超过 60s，孢子致死率几乎达到 100%所以紫外线照射时间应严格控制在 60s 以内，这有别于其它的一般链霉菌。
随机挑取一定数量菌株经 UV 诱变的灰色菌落发酵培养后测定 avermectin 的产量，发现其产抗能力较出发菌落均有明显提高再从中挑选 24 个产抗能力强的菌落在平板上反复传代，进一步发酵筛选，获得一菌落特性和产量都较为稳定的突变株 A1，发酵效价达 24657μg/ml，B1a 的比例为 371%，较出发菌株有明显提高将此突变株进行下一步诱变处理表 1 除虫链霉菌 N56的紫外线诱变效果 照射时间52.2 NTG 诱变及筛选随机挑取经 NTG 诱变后的单菌落转接于斜面，进行筛选，实验结果如表 2由表 2 可知，在 pH 60 条件下，NTG 的作用浓度为 1mg/ml 时诱变效果最佳与出发菌株相比，正突变率达到 161%，大于其它处理条件，负突变率最低为 448%但随着 NTG 浓度的增大，孢子的死亡率逐渐增加，产量正突变率逐渐降低，负突变率逐渐增加当 NTG 浓度达到 3mg/ml 以上时，正突变率为零，负突变率 85%～89%因此用低浓度的 NTG 作为诱变剂进行菌种选育经分离、筛选获得突变株 A22.3 Met 平板筛选已研究证实 Met 可促进 S 腺苷甲硫氨酸(SAM) 表 2 NTG 的诱变结果 NTG 浓度因此筛选降解甲硫氨酸能力强的菌株，使甲硫氨酸尽可能地流向能量代谢［4］，以减少 SAM 合成前体的供给，使菌体内 SAM 含量相对降低，获得 B 组分含量较高的菌株。
向培养基中加入低浓度的 Met，诱变菌体降解甲硫氨酸的能力向培养基中加入低浓度的甲硫氨酸，在 pH60，1mg/ml NTG，28℃水浴处理 30min 的诱变条件下，诱变效果见图 2由图 2 可知，加入 Met 后菌株 A2 的孢子致死率显著上升，avermectin 正突变率比单纯 NTG 诱变有所下降，负突变率增加，但 B1a 组分比例正突变率显著上升加入 025mg/ml 的 Met，B1a 组分比例增加的菌株达到 149%随着 Met 浓度的升高，菌落生长明显受到抑制，孢子明显减少，B1a 组分比例正突变率有所下降实验分离、筛选获得突变菌株 A32.4 摇瓶效价分析由表 3 可看出，诱变处理出发菌株，获得的突变株 A3 的总效价及 B1a 百分比例均显著提高，前者效价达到 45258μg/ml，后者组分提高 560%，明显高于出发菌株 N562.5 突变菌株的遗传稳定性考察将诱变获得的突变菌株 A3 通过斜面传代，得到6各代子斜面菌株后进行摇瓶发酵，测定各代菌株产量及 B1a 组分含量的稳定性，F1～F5 代的发酵总效价及 avermectin 中 B1a 组分比例见表 4 表 3 出发菌株和突变菌株的摇瓶效价测试比较由表 4 可见，突变株经 A3 多次传代，avermectin 总效价虽有所下降，但其 B1a 组分比例基本上比较稳定。
证实本实验中所用的诱变筛选方法可有效筛选出 avermectin B1a 高产菌株3 讨论(1)avermectin 产生菌的菌落特征很不稳定，存在严重的自然分化现象，在不同菌落形态的分化菌株中，产灰色孢子的菌株能产生 avermectin，但即使经单孢子选出的灰色菌落经传代后，仍分化出不产 avermectin 的白色和光秃菌落，因此诱变处理后应从分离培养基上挑取产抗能力强的灰色孢子进行发酵培养，以平衡经常出现的发酵效价不稳定现象2)菌体内 S 腺苷甲硫氨酸(SAM)浓度起到调控avermectins 的 C5 位甲氧基化程度作用当菌体内 SAM 含量升高时，可以增加avermectin A 组分的比例，而减少菌体内 SAM 的含量可以使 。