1实验模式动物实验模式动物—斑马鱼斑马鱼生药学生药学 张彩张彩Use Zebrafish AS A Model Organism 2汇报内容汇报内容•斑马鱼概况斑马鱼概况•斑马鱼作为模式生物的优点斑马鱼作为模式生物的优点•斑马鱼在药物的评价中的应用斑马鱼在药物的评价中的应用•采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性毒性毒性 3概概 况况•70年代早期，斑马鱼仅在一个研究中心被详细研究：在位于Eugene 的 俄勒冈大学， Charles Kimmel 及其同事开始将斑马鱼作为研究发育的动物模型，并探索其作用第一部分Chuck Kimmel 4斑马鱼作为模式动物逐渐受到关注斑马鱼作为模式动物逐渐受到关注Turn Eyes to Fish•Christiane Nüsslein-Volhard •1995 诺贝尔奖获得者was able to identify and classify a small number of genes that are of key importance in determining the body plan and the formation of body segments, turned eyes to fish and find a wide range of mutationsWolfgang Driever 5斑马鱼基本特性•产于热带印度，孟加拉国。
•成鱼体长4～6厘米体呈纺锤形雌雄易区分•性情温和，对水温水质要求不高，易饲养•属卵生鱼类 ，4月龄进入性成熟期繁殖期约7天左右产卵量高，繁殖力很强 •体外受精，胚胎透明，在24小时内就可发育成形， 2~3天孵出仔鱼 6♀♂斑马鱼的繁殖斑马鱼的繁殖 7斑马鱼胚胎早期发育图谱斑马鱼胚胎早期发育图谱 8斑马鱼作为模式生物的优点斑马鱼作为模式生物的优点 1.斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视2.斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对其体内器官的影响3.此外，雌性斑马鱼可产卵数百枚，胚胎在24小时内就可发育成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因 9心血管系统发育心血管系统发育Development of Zebrafish Vascular System Nature Medicine, 1995 10 Development of Zebrafish Vascular System28 hours 1.5 days 2 days 2.5 days 3 days 3.5 days 4.5 days 5 days 6 days 7 days 11斑马鱼的骨骼发育斑马鱼的骨骼发育缺少缺少chordin表达的斑表达的斑马鱼的马鱼的BMP蛋白水平蛋白水平异常，鳍和尾部骨架异常，鳍和尾部骨架也异常也异常—注射注射chordin mRNA后可恢复。
因后可恢复因此研究者使用斑马鱼此研究者使用斑马鱼的这项特性来进行基的这项特性来进行基因筛查，以确定脊椎因筛查，以确定脊椎动物骨骼形成的调节动物骨骼形成的调节机制 —Rik DerynckNature Genetics ,1999 12斑马鱼的心脏再生斑马鱼的心脏再生 Heart Regeneration in Zebrafish•斑马鱼的Mps1 mitotic checkpoint kinase是 一个至关重要的细胞周期调节因子，如发生突变，则斑马鱼的心脏不能被修复而形成疤痕因此，损伤诱导的斑马鱼心肌细胞增殖可以克服疤痕形成，使心肌再生这个发现表明斑马鱼在分析心脏再生的分子机制方面起重要作用 1313 DECEMBER 2002 VOL 298 SCIENCE 心脏切除后心室肌的再生心脏切除后心室肌的再生 Regeneration of ventricular myocardium in the resected zebrafish heart 14斑马鱼在药物评价中的应用斑马鱼在药物评价中的应用1.一般毒性评价2.发育毒性评价3.心血管毒性评价4.肝脏毒性评价5.神经毒性评价6.肾毒性评价7.肠胃毒性评价8.视觉毒性评价9.耳毒性评价10.软骨毒性评价 15斑马鱼在药物评价中的应用斑马鱼在药物评价中的应用1.一般毒性评价：在化合物的一般毒性评价可在胚胎、幼鱼、成鱼的各个阶段进行,相应的观察指标略有不同。
在胚胎期,在化合物的作用下可观察终点有卵凝结、体节形成、尾部延展、心跳、色素沉着、孵化率、畸形率等幼鱼和成鱼主要是统计LC50、死亡率等2.发育毒性评价：在胚胎发育和幼鱼发育过程中,很多器官系统的形成过程对药物的介人是相当敏感的,比如脑、心血管、肝脏、软骨、脊索、胰腺、肠道、肾脏,极易导致畸形的产生,是评价药物致畸性的有效模型之一 16斑马鱼在药物评价中的应用斑马鱼在药物评价中的应用3.心血管毒性评价：心脏是斑马鱼第一个发育起来并发挥作用的器官,也是很多化合物的首要作用靶点由于胚胎和幼鱼的透明性,无需借助遥测或其他技术就可以实时观察心跳、心脏的收缩性、血液循环,非常的便利4.肝脏毒性评价：药物引起的肝损伤是制药业一个主要的毒理学问题目前,应用斑马鱼进行的肝脏毒性评价终点主要有血清酶、肝细胞凋亡、细胞色素P450和组织病理学变化 17斑马鱼在药物评价中的应用斑马鱼在药物评价中的应用5.神经毒性评价：斑马鱼胚胎在24hpf原代神经元细胞开始分化,48hpf脑室形成,在6dPf所有的神经系统形成,斑马鱼可在短时间呈现整个神经系统,可作为一个有机载体,建立一个快速的、有效的评价药物神经毒性的平台。
6.肾毒性评价：斑马鱼的原肾由一对肾单位、两个肾小球和前肾小管组成,较为简单庆大霉素可引起哺乳动物肾中毒,其表型在斑马鱼原肾上也可看到,既肾小球滤过率降低尽管结构的复杂程度不一样,但是在肾损伤表型方面却是保守的所以以斑马鱼为肾毒性评价载体,能为药物在临床上的应用提供重要的参考价值 18斑马鱼在药物评价中的应用斑马鱼在药物评价中的应用7.胃肠毒性评价：斑马鱼的胃肠系统和人体胃肠系统有着千差万别,斑马鱼没有胃,肠道直接开始于咽部下的一小段食道之后在发育的早期肠道就开始蠕动,在未喂食时就自发的游走性蠕动,由于幼鱼是透明的,这些蠕动清晰可见8. 视觉毒性评价：斑马鱼有着与人类相似的锥形视网膜,有色彩视觉,这点超越了喜好夜间活动的啮齿类模式生物同时,斑马鱼胚胎期视觉系统发育迅速,幼鱼就展示了视觉介导的行为,故可用于评价化合物对视觉的影响 19斑马鱼在药物评价中的应用斑马鱼在药物评价中的应用9.耳毒性评价：斑马鱼侧线上的神经丘在结构和功能上就相当于人内耳的毛细胞神经丘在侧线上从头至尾排列,胚胎时期在光镜下清楚可见,有助于药物作用下,观察其形态和功能变化10.软骨毒性评价：斑马鱼的骨头与人类的相似,颅面骨骼都有膜内和软骨内成骨。
斑马鱼也有成骨细胞核和骨细胞,并布满血管,受神经支配 20采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性毒性采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性毒性 1.主要试剂：雷公藤甲素( tripto lide) , 中国医学科学院协和医科大学皮肤病研究所(江苏, 南京) 惠赠,纯度大于98% . 大黄素( emod in) , 瑞雷植化制剂厂提供, 含量98%. 苦参碱( matrine), 江苏天晟药业有限公司产品, 含量98%. DMSO 为S igma公司产品(美国)超纯水取自M illipore 超纯水机 212.方法：实验前一天禁食取成体斑马鱼分别置于含有30~ 50mL溶液的瓶中, 保持瓶中溶液温度恒定在25℃，随机分为空白对照, 溶剂对照及各药物浓度给药组, 每组含15条分别给予纯净水, 含不同浓度药物的纯净水 记录不同浓度药液中斑马鱼在24h内的死亡数量(只), 计算死亡率(% )根据实验结果, 采用Bliss法计算LC50值 223.结果：雷公藤甲素、苦参碱和大黄素对于斑马鱼的LC50值依次为5.02 x10-3、113.2和1.18 x103 ug /mL, 毒性大小顺序与文献报道基本一致。
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