SDS-PAGE检测蛋白质纯度1. 电泳的基本原理许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的 pH 及其组 成由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下， 各组分泳动的方向和速度也各异，因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达 到分离鉴定各组分的目的2. 影响电泳的主要因素2.1电泳介质的pH 当介质的pH等于某种两性物质的等电点时，该物质处于等电状态， 即不向正极或负极移动当介质pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极：反之， 介质pH大于其等电点时，则呈负离子状态，移向正极因此，任何一种两性物质的混合物 电泳均受介质pH的影响，即决定两性物质的带电状态及其量，为了保持介质pH的稳定性， 常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白质常用pH8. 6的巴比妥或三羟甲基氨基甲烷（Tris） 缓冲液2.2缓冲液的离子强度离子强度对电泳的影响是：离子强度低，电泳速度快，分离区带 不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰如离子强度过低，缓冲液的缓冲量 小，不易维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量（压缩双电层）使电脉速度 减慢。
所以常用离子强度为 0.02-0.2之间2.3电场强度 电场强度和电泳速度成正比关系电场强度以每厘米的电势差计算，也称 电势梯度如纸电泳的滤纸长 15cm，两端电压（电势差）为 150V，则电场强度为150/15=10V/cm,电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快电压增加，相应电流也增大，电 流过大时易产生热效应可使蛋白质变性而不能分离2.4电渗作用 在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗如滤纸中含有表面带负电 荷的羧基，溶液则向负极移动由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也 受电渗影响，如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白质泳动的距离， 等于电泳移动距离减去电渗距离如电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距离，等于二 者相加电渗现象所造成的移动距离可用不带电有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中间， 观察电渗方向和距离2・5对支持物的选择 一般要求支持物均匀，吸附力小，否则电场强度不均匀，影响区带 的分离，实验结果及扫描图谱均无法重复如纸电泳时，滤纸厚薄不均匀或吸附力过大，则 蛋白质或其他胶体颗粒在它们泳动过程中有一部分被滤纸吸附，造成分离区带蛋白含量相对 量降低。
因此，电泳前应事先处理滤纸，以减低滤纸的吸附能力，可取得较好的分离效果 若选用 Whatwan No.1 号滤纸或国产新华滤纸，一般不需要进行预处理2.6温度对电泳的影响电泳过程中由于通电产生焦尔热，热对电泳有很大的影响温度 升高时，介质粘度下降，分子运动加剧，引起自由扩散变快，迁移率增加温度每升高1 度，迁移率约增加 2.4％为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，也可在电泳系 统中安装冷却散热装置3. 电泳的分类3.1 按分离原理分类 可分为区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳4种1） 区带电泳 电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液中分离成独立的区带，这是当 前应用最广泛的电泳技术2） 移界电泳 是Tiselius最早建立的电泳，它是在U型管中进行的，由于分离效果较差， 已为其它电泳技术所取代3） 等速电泳 需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各区带相随分成清晰的界面，并以等速移动4）等电聚焦 由于具不同等电点的两性电解质载体在电场中，自动形成pH梯度，使分离 物移动至各自等电点的pH处聚集成很窄的区带，且分辨率较高从表面看与区带电泳相似， 但原理不同3.2 区带电泳的分类1） 按支持物物理性状分类1. 滤纸及其他纤维素膜如乙酸纤维膜、玻璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。
2. 粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳3. 凝胶电泳，如琼脂糖、琼脂、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳4. 丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳2） 按支持物的装置形式不同分类1. 平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式2. 垂直板式电泳3. 连续流动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，缓冲液和 样品自顶端下流，与电泳方向垂直可分离较大量的蛋白质以后有用淀粉、纤维素粉、玻 璃粉等代替滤纸，分离效果更好3） 按pH的连续性不同分类1. 连续pH电泳：电泳全部过程中缓冲液pH保持不变如纸电泳、乙酸纤维膜电泳2. 不连续pH电泳：缓冲液与支持物之间有不同的pH,如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、 等电聚焦电泳、等速电泳等，能使分离物质区带更加清晰，并可作ng级微量物质的分离不连续电泳与连续电泳的主要区别在于前者①有两层不同孔径的凝胶系统；②电极槽 中及两层凝胶中所用的缓冲液pH值不同；③电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀而后者 在这三个方面都是单一或是均匀的4． 几种常见的电泳方法4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体 的一种区带电泳，这种凝胶由丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂N, N -甲叉基 （亚甲基）双丙烯酰胺（N, N -methylene-bis-acrylamide,简称Bis）聚合而成。
聚丙烯酰 胺凝胶具有机械强度好，弹性大，透明，化学稳定性高，无电渗作用，设备简单，用样量少 （l-100“g）和分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径 大小不同的凝胶，可用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析还可结合去垢剂十 二烷基硫酸钠（SDS）,以测定蛋白质亚基分子量聚丙烯酰胺的聚合反应及其结构如下：『眄 岁阻 ? IIn — CH2— CH— CH2 — CH一 CH? — CH +CH — CH —C™NH~ CH2—NH—C—CH= CH:CONH:（Act单体长链）.(Bis)CONH2 CONH—CH? —CH — CH?— CH— CH? - — CHa — CH—l：ONHCONHCH[Cohii CONHi CONH— CH — CH3—CU —CH3— CH —CH2 — (Ju— CH2 — CHCONHCONHiconh2CH]conh2— CH — CH2— CH — CH3 — CH — CH2— CH—CH3—CHCONHCONHconh2CONH图 APS 引发 TEMED 催化 Acr 与 Bis 的聚合反应Acr或Bis无论单独存在或混合在一起都是稳定的，一旦出现自由基团时，就会发生聚 合反应。
自由基团的引发有化学和光合两种方法，化学法的引发剂是过硫酸胺（简称Aps）, 催化剂为四甲基乙二胺（简称TEMED）；光化学法是在光线照射下，由光敏感物质核黄素 来引发，催化剂也是TEMED由于单体及交联剂、引发剂和催化剂的浓度、比例、聚合条 件等的不同，便可产生不同孔径的凝胶一般而言，凝胶浓度愈大，交联度愈大孔径愈小凝胶浓度的选择与被分离物分子量及其性质有关，其大致选用范围如下表：表: 分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度（％）蛋白质< 10420 -—301— 4X10415 -—201— 5X104—1X10510 -—151X1055 —-10> 5X1052甘核酸（RNA）< 10415 -—20104—1055 —-10105—2X 1062 -—2.6根据凝胶形状可分为盘状电泳和板状电泳盘状电泳是在直立的玻璃官内，利用不连续的缓冲液的pH值进行电泳，同时，由于样品混合物被分开后形成的区带非常窄，呈圆盘 状（discoid shape），故而得名板状电泳（垂直或水平）是将丙烯酰胺聚合成方形或长方形 平板状，平板大小和厚度视实验需要而定垂直平板电泳有如下优点:①表面积大，易于冷 却，便于控制温度；②能在同一凝胶板上，相同操作条件下，同时点加多个样品，便于相互 比较；③一个样品在第一次电泳后，可将平板转90度进行第二次电泳即双向电泳；④便于 用各种方法鉴定（如放射自显影等）。
其缺点是制备凝胶时操作较复杂，电压较高，电泳时 间较长凝胶的机械性能，弹性、透明度和粘着度取决于凝胶总浓度通常用T%表示总浓度， 即100mL凝胶溶液中含有Acr及Bis的总克数Acr和Bis的比例常用交联度C%表示，即 交联剂 Bis 占单体 Acr 和 Bis 总量的百分数凝胶的孔径主要受总浓度T%的控制通常T%越大，平均孔径越小，凝胶的机械强度 增加实验表明，当T%值固定时，Bis浓度在5%时孔径最小，高于或低于5%时，孔径 却相应变大为了在使用凝胶做实验时有较高的重现性，制备凝胶所用的Bis浓度，Bis和 Acr的比例，催化剂的浓度，聚合反应的溶液pH值，聚胶所需时间等，凡能影响泳动率的 因子都必须保持恒定欲将蛋白质或核酸类大分子混合物很好地分离，并在凝胶上形成明显 的区带，选择一定孔径的凝胶是关键文献中常见的标准凝胶是指浓度为7.5%，凝胶孔径 平均为5nm大多数生物体内蛋白质在此标准凝胶中电泳均能得到满意结果不连续凝胶电泳的支持体由样品胶、分离胶和浓缩胶组成样品胶为最上层；中层为 浓缩胶，一般Acr为2%-3%，缓冲液为不同浓度的Tris-HCl、pH为6.7左右；分离胶为最 下层，Acr为5%-10%，缓冲液常用Tris-HCl,pH为8.9。
上下电泳槽盛有pH为8.3的Tris- 甘氨酸缓冲液，上电泳槽接电源的负极，下电泳槽接正极不连续凝胶电泳的分离原理如下:1. 样品的浓缩效应1）凝胶层的不连续性：浓缩胶与分离胶中所用原料总浓度和交联度不同，孔径大小就 不同前者孔径大，后者孔径小带电荷的蛋白质离子在浓缩胶中泳动时，因受阻力小，泳 动速度快当泳动到小孔径的分离胶时，遇到阻力大，移动速度逐步减慢，使样品浓缩成很 窄的区带2）缓冲液离子成分的不连续性，最上层电极缓冲液中甘氨酸在pH 8.3时，可部分解离 为NH2CH2COO-三层胶中的缓冲液都是Tris-HC1,HC1在各自pH条件下均被全部解离为 Cl-，而在pH6.7时蛋白质被解离带负电（因大部分蛋白质pI值为5.0左右，通电后，电极 缓冲液中的甘氨酸进入浓缩胶缓冲液，pH由8.3变为6.7），使甘氨酸解离度降低，负电荷 减少，迁移率明显下降（称慢离子），相反Cl-处于解离状态，且颗粒和摩擦力最小，其迁移 率最大（称快离子），结果在浓缩胶中，离子迁移率为Cl-＞蛋白质-＞甘氨酸-由于Cl-的快速 移动，使在Cl-后面胶层中的离子浓度骤然降低，形成一个低电导或称高电位梯度（电位差） 区域（电势梯度E-电流强度I/电导率n），因为电泳速度取决于电位差和有效迁移率，所以 在此区域中，使蛋白质离子及甘氨酸离子加速向阳极移动。
当快离子、慢离子和蛋白质的迁 移率与电位梯度的乘积彼此相等时，则3种离子移动速度相同在快离子和慢离子的移动速 度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的 界面也就是说，在高电位梯度和低电位梯度之间形成一个迅速移动的界面（见图24）由 于蛋白质离子的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此就聚集在这。