深度测序技术简介

Sample fragmentationLibrary preparationSequencing reactionData analysisRoche 454 Roche 454 焦磷酸测序焦磷酸测序 Pyrophosphate SequencingPyrophosphate SequencingIllumina Solexa Illumina Solexa 合成测序合成测序 Sequence by SynthesizeSequence by SynthesizeABI SOLiD ABI SOLiD 连接法测序连接法测序 Sequence by LigationSequence by Ligation深度深度( (高通量）测序技术简介高通量）测序技术简介Roche 454 焦磷酸测序 Pyrophosphate Sequencing 基本原理边合成边测序（sequencing by synthesis）454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购目前，Roche 454 GS FLX Titanium每次运行 能产生100万条序列，平均读长能达到400nt ，且第400个碱基的准确率能达到99%。

一次 运行所需时间为10小时，能获得4-6亿个碱基 的序列信息Mix DNA Libraryfluor removalODNAHNNOO3’O5’free 3’ endXOH•All 4 labelled nucleotides in 1 reaction5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’CAGTCATCACCTAGCGTAFirst base incorporatedCycle 1: Add sequencing reagentsRemove unincorporated basesDetect signalCycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可 以被去除的阻断基团2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序 反应123789456T T T T T T T G T …T G C T A C G A T …The identity of each base of a cluster is read off from sequential images 根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相 应的DNA序列Base calling from the raw dataSolexa 测序 WorkflowABI SOLiD 连接法测序 Sequence by Ligation 基本原理2010年末又发布了最新产品--SOLiD 5500xl测序 平台。

SOLiD 5500xl含有两张微流体芯片（microfluidic FlowChip），每张芯片含有6条相互独立的运行 通道（run lane）每条lane都能运行相对独立 的测序反应，这样的设计使得SOLiD 5500xl测序 平台极具灵活性最大测序读长为75nt，同样支 持Fragment、Pair-end和Mate-Paired文库单 次运行能得到的最大数据量为300Gb（使用最新 设计的nanobeads）测序的系统准确性能达到 99.99%文库制备：微珠单分子克隆1024种8碱基探针 4色荧光，4种双核苷酸，每色荧光有256个探针(4^6)SOLiD 利用探针的连接反应读取模板的DNA序列绿宇生物科技 专业建库 测序 :110199525每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基，因此一条测序引物读取的序列是不完整的测序引物与adapter退火探针连接，检测荧光切除荧光基团第二轮探针连接，检测荧光切除荧光基团连接法测序 （二）测序引物沿着Adapter移动5次，确保每个位点都被检测连接法测序 （三）0位置是Adapter的最后一个碱基，因此只检测一次， 该碱基是进行解码所必须的。

454 sequencing读取长度大，400bp可以对未知基因组进行从头测序de novo sequencing当遇到polymer时，如AAAAAA等，荧光强度和碱基个数不成线性关系，判定重 复碱基个数有困难Solexa sequencing高度自动化的系统读取片段多，适合进行大量小片段的测序，如microRNA profiling基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降低，信号衰减，读取序列较短，给de novo sequencing 拼接带来困难SOLiD sequencing每个碱基读取两次非常高的准确性，特别是对于SNP的检测灵活的系统，完善的磁珠编码系统，可以进行样品的pooling，分割测序区域读取长度受连接反应的轮数限制，给de novo sequencing 拼接带来困难De novo 测序基因深度测序（genome re-sequencing）转录组深度测序（transcriptome re-sequencing）Digital expression profilingChIP-seqMethy-seqTranscriptome resequencing：malignant pleural mesotheliomas (MPMs) ：恶性胸膜间皮瘤 pulmonary adenocarcinoma (ADCA)：肺腺癌Transcriptome characteristicsSolid line： at least one read Dashed line：at least 20 readsExpression difference between MPM and ADCA sample compare to a lung tissue controlAnalysis of percent- age of reads containing known coding region SNVs in the six tissue samples.SNV： Single Nucleotide Substitution VariantDigital expression profiling 52(1):7-16 DNA sequencing technologies. Sci China C Life Sci. 2009 ;52(1):7-16 高通量测序技术虽然建立的时间不长高通量测序技术虽然建立的时间不长, , 但是在基因组的各个研究领域都显示但是在基因组的各个研究领域都显示 出其非凡的魅力出其非凡的魅力, , 而且日益显示出其对基因芯片而且日益显示出其对基因芯片“ “取而代之取而代之” ”的咄咄态势。

的咄咄态势 那么那么, , 基因芯片向何处去呢？基因芯片向何处去呢？ 1. 1.基因芯片技术经过近基因芯片技术经过近1515年的发展已经形成了一个系统的平台年的发展已经形成了一个系统的平台 深度深度 测序要建立这样的一个体系同样需要若干年的完善测序要建立这样的一个体系同样需要若干年的完善 2.2.芯片杂交结果直观芯片杂交结果直观, , 分析快速分析快速, , 适合对大量生物学样适合对大量生物学样, ,品进行已知信品进行已知信 息的检测息的检测, , 同时芯片数据分析有成熟完整的理论同时芯片数据分析有成熟完整的理论, , 为后期数据分析提为后期数据分析提 供强大的支持供强大的支持 3.3.基因芯片的缺点基因芯片的缺点, , 就在于它是一个就在于它是一个“ “封闭系统封闭系统” ”, , 它只能检测人们已知它只能检测人们已知 序列的特征序列的特征( (或有限的变异或有限的变异) ) 4.4.而深度测序的强项而深度测序的强项, , 就在于它是一个就在于它是一个“ “开放系统开放系统” ”, , 它的发现能力和寻它的发现能力和寻 找新的信息的能力找新的信息的能力, , 从本质上高于芯片技术。

从本质上高于芯片技术 在一定程度上，这两种技术是优势互补，联合在一定程度上，这两种技术是优势互补，联合 使用，将加快和加深我们的研究使用，将加快和加深我们的研究。