开题报告苯酚对发光菌Q67的急性毒性研究一、 选题的背景、意义随着工农业生产的不断发展、城镇建设规模的日益扩大，全球环境污染日趋 严重，化学品的环境污染日益突出据报道全球目前大约有10万多种合成化学品 释放进入环境中成为环境毒物，而且还以每年1000种新化合物的速度递增⑴苯 酚、苯胺等作为重要的化工原料，其生产量和使用量占芳炷总量的90%以上这 些物质在满足人类生产、生活需要的同时也不可避免的进入到环境中，从而给环 境带来污染⑵，是水环境的主要污染物之一美国环保局(EPA)水质调查发现供水 系统中有机污染物有2110种，饮用水中含765种1994年以来,美国在饮用水中 发现了 100多种合成有机物，如多氯联苯、多环芳炷等，具有“三致”作用关 于水环境中有机物的降解问题己迫在眉睫关于有机污染物对水环境造成影响的研究工作，国内外开展了很多研究，n 前用得较多的检测污染生物毒性的方法是从医学毒理学的方法引用过来的小鼠 或是鱼类或是藻类进行毒性实验由于时间长，成本高，而不易普遍推广应用20世纪80年代发展起来的Microtox方法，采用发光细菌作为毒性测试的指 标生物，根据测定发光强度的减弱程度，判断污染物的毒性强弱。
研究表明大部分 有机污染物的浓度与对发光细菌的毒性呈明显正相关⑶一般来说，进行一次发 光菌对污染物或毒性物质的检测实验，只要0.5.1小时短时间就可以知道被测试 物有没有毒性或毒性多大发光菌的急性毒性检测由于其耗时短、成本低、反应 灵敏，从而可用于必须公示的敏感项目竣工环境验保护收的监测，在水环境的检 测中有很强的实用性和可推广前景我们现在使用的发光菌检测方法是将发光菌先培养好，制成冻干粉，以保存 在.20C以下的冰箱中，使用前仅需加入复苏液，几分钟之后冻干粉恢复活力， 就可以即用于检测毒性物质二、 生态毒理学研究的现状及动态发展1、测试方法研究现状进入21世纪以来，随着科学的不断发展进步，人类合成越来越多的化学 品，水环境最为工农业废物的最终排放点，污染现象越来越严重超过了其自净能 力，从而影响水体的正常功能，造成水体污染这些生活污水绝大多数来自城市生 活污水和造纸、采矿、印染等工业废水，这些成分中有一部分属于难降解污染物 其本身及其在水体中的转化产物在水体中长期积累，达到很高的浓度，不仅影响 水生生物种群和群落结构的变化，而且严重时将导致水生生态系统的破坏和崩 溃水体污染物达到一定浓度后除了直接影响水生生物的正常生活外还直接或间 接的威胁人类健康和生产活动，因此为了保护水源和水生生态系统，利用化学方 法和生态毒理学测试法进行评价。
化学方法是普遍采用的一种方法但化学方法存 在许多不足［句，而现有的分析手段十分有限，因此大多数污染物不能被鉴定，而 旦也不能预测毒物之间的相互作用生态毒理学测试法可以弥补化学方法的不足，在一定程度上能预测毒物之间 的相互作用生态毒理学是七十年代发展起来的一门新兴的边缘科学，主要研究 污染物——环境——计量三者之间的关系以及有毒物质对生物在个体、种群、群 落和生态系统水平上的毒性效应以前毒性方面的许多研究工作是用水生态系统 食物链中各代表生物如藻、蚤、鱼等进行急、慢性实验，并用这些结果作为评价 环境化学物质的毒性强度及可能对生态系统造成影响的一种指标现在这些方法 很多都已做成规检测方法但它存在耗时长、花费大、只能反应对个体和群落的后 期影响等问题，而发光菌的急性毒性试验能与现代光电检测手段相匹配，具有测 试速度快、经济、节省空间且可靠等优点而备受关注2、测试、研究方法举例黄伟英，陈鸿汉，刘菲等人［习选择了苯酚、间甲基苯酚、苯胺、对硝基苯 胺、硝酸铅5种污染物，采用美国微板光度计测定了它们对发光菌青海弧菌 -Q67(Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67)的单一及联合毒性应用非线性拟合技术模拟 了这5种物质及其混合物的剂量-效应曲线，硝酸铅可用Logit模型模拟，其它4 个物质能用Weibull模型准确描述，所有拟合相关系数在0.98以上,均方根误差在 0.02以下。
根据纯物质的EC50值,获得这5个物质的毒性强弱顺序:硝酸铅〉对 硝基苯胺〉］TiJ甲基苯酚〉苯酚〉苯胺用浓度加和模型(dose addition,DA)和独立作 用模型(independent action,IA)对混合物毒性进行预测IA基本准确测定了这五种 物质在各自EC50的混合毒性林春等人⑹应用TU、AL MTL九指数分别研究了 2, 4-二硝基甲苯与对 硝基氯苯、对硝基苯胺、对硝基苯甲醍、对硝基甲苯、对硝基苯酚等剂量混合时 对明亮发光杆菌的联合毒性，最后评价2, 4-二硝基甲苯与这5种对位硝基苯的衍生物在等剂量混合肘对发光菌的联合毒性均为协同作用覃记杰、刘树深□以淡水发光菌青海弧菌为指示生物，VcritasTM微孔板光 度计为发光强度测试设备，分别测定了 8种硝基苯类化合物及其混合物对发光菌 的发光抑制毒性结果表明8种硝基苯类化合物的剂量-效应关系都可用Weibull 模型有效描述，从模型估算的单个化合物的半数效应浓度值，可知对发光菌的毒 性大小顺序为邻硝基苯胺〉对硝基苯胺〉对硝基苯酚〉对硝基甲苯〉邻硝基苯酚〉 间硝基苯酚＞间硝基苯胺〉硝基苯按等毒性浓度比方法配制混合物进行联合毒性 实验，结果表明这8种硝基苯类化合物对•发光菌的联合毒性可用独立作用(IA)预 测，独立作用(IA)倾向于高估了它们的联合毒性。
三、课题的研究内容及拟采取的研究方法(技术路线)、难点及 预期达到的目标1、研究内容及目标本次研究主要是通过查阅文献，收集苯酚对发光菌Q67的急性毒性研究的 相关背景、理论方法及实验方法，确定苯酚对发光菌Q67的急性毒性的影响1) 、发光菌的选择及原理：发光菌试验一,般所用的明亮发光杆菌(Photobactcrum phosphrcum)[8]为海洋 性发光细菌，正常发光需要3%NaCl的存在，这对海洋污染的毒性测试比较合适, 而在淡水体系样品中也要加入3%NaCl，如此高浓度的氯离子会影响水中的一些 污染物，有十分明显的局限性青海弧菌”是科研人员于1985年从青海湖采样 获得,在1990年确定为一种新的淡水型发光菌，即不需要NaCl就可以正常发 光，并且该菌是全世界唯一由中国学者命名的发光细菌新种用”青海弧菌” 检测环境水质，对淡水样品无需加NaCl至3%的浓度就可以检测，而且该菌对 外界有毒物质反应很灵敏，所以选用青海弧菌的典型菌种Q67作为实验菌种 它在NaCI浓度为1%时生长最好，在8%时为生长的上限，表明它有较高的耐高渗 透压的能力，实际上它不需要NaCI的存在即可良好发光(对Na+的依赖性是海洋 细菌的重要特征）。
温度适应范围广，10・35度均能发光在pH值为6.5至11范围内 能生长和发光，尤其在pH=9左右生长和发光最佳它的生物发光光谱峰值在 484nm左右,发光峰半高宽约90nm,发光频谱范围为420---660nm.对金鱼的感 染试验表明它为非致病菌Thomulk[,0]认为外来受试物通过下面两个途径抑制细 菌发光：（1）直接抑制参与发光反应的酶类活性；（2）抑制细胞内与发光反应有关 的代谢过程（如细胞呼吸等）-发光菌是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光 菌发光强度的影响实验结果显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系, 因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光强度表征毒物所在环境 的急性毒性青海弧菌的典型菌种Q67的发光原理是由于活体细胞内具有ATP、荧光素 （FMN）和荧光酶等发光要素这种发光过程是细菌体内的一种新陈代谢过程，即 氧化呼吸链上的光呼吸过程当细菌合成荧光酶、荧光素、长链脂肪醛时，能发 生生化反应，便产生光生化反应如下：基质I ATP ATP ATP还原型辅酶A-黄素（足）一细胞色素C 一 02载氢黄素单核甘酸荧光酶（E） ；02[RCHO RCOOHE-FMNH2 一 E-FMNH 光+FMN+ 电子+H2OOOH 喑反应I 电子+黄素单核昔酸+h2o2 当细胞活性高，处于积极分裂状态时，细胞ATP含量高，发光强；休眠细胞 ATP含量明显下降，发光弱；当细胞死亡，ATP立即消失，发光停止。
处于活性期的发光菌，*加入毒性物质（如有机物、重金属、酸、碱等）， 菌体就会受抑甚至死亡，体内ATP含量也会随之降低甚至消失，发光度便下降甚 至到零由于毒物浓度与菌体发光度呈线性负相关地变化，因而可根据发光度确 定毒物生物毒性若此毒物知其成份而不知其浓度，则可根据先前测得的发光度 一毒物浓度关系曲线（标准曲线），测定浓度2、研究方法配置不同浓度的苯酚溶液；将发光菌冻干粉复苏并培养成菌种〔⑴；测定苯酚 对发光菌的毒性（EC50）数据；绘制其计量.效应曲线；对计量.效应曲线进行非线 性最小二乘法模拟；得出其计量■效应曲线的同归方程3、 试剂与仪器苯酚试剂（分析纯）；青海弧菌Q67冻干粉，向外购买；DXY-2型生物毒性测试仪（实验室提供）；THZ-C恒温振荡器（实验室提供）；隔水式培养箱，高压灭菌锅，比色管架.4、 培养液及培养基的配置酵母膏5.0g族蛋白腺5.0gNaCl30gNa2HPO45.0gKH2PO41.0g甘油3.0gpH7.00.5培养基的配置培养液（按上述配方）lOOOmL琼脂粉 16gpH 7.00.55、发光细菌冻干菌剂的复苏及培养选用华东师范大学生物系提供的淡水发光菌一青海弧菌（Q67菌种），将装有 冻干粉的安培瓶先置于4度冰箱内约10〜15min,在超净工作台中切开安培瓶，用 ImL注射器吸取0.5mL冷的2%NaCl （适用于5mL测试管）或ImL冷的2%NaCl （适 用于2mL测试管）注入己开口的冻干粉安培瓶。
务必充分混匀！投入置有冰块的 小号(1〜1.5L)保温瓶2分钟后菌即复苏发光，取己灭菌的O. 8%NaCI溶液lOOmL 点在培养皿平板上，用接种环取一•环菌种蘸取点的溶液在平板上划线，倒置放于 恒温培养箱中于22度培养24 h；挑取单个菌落接种于斜面培养基上，于22度培养, 24 h后转接于斜面，将培养好的第三代斜面置4度冰箱中备用；将培养好的菌种 接种到15 mL液体培养基中，22C振荡培养15.22 h (生长至200万以上可以使用)， 以保证Q67处于对数生长期用接种环取一环第三代斜而培养的菌种转接入盛有 30mL培养液的lOOmL三角瓶，20C恒温振荡培养12h后备用6、毒性测试该实验在室内温度20C条件操作，实验前24h配置待测样品储备液，进行 预实验以确定适当的浓度范围，其目的是找出发光抑制率在50%上下时对应的浓 度具体做法是假定母液的浓度为a,预试验的浓度范围为0.1a, 0.01a, O.OOUo 根据测定结果，找出发光抑制率在50%上下时对应的浓度范围，接着按等对数间 距用3%NaCI溶液稀释储备液配制数个浓度梯度，当然不同的化合物测定结果不 同而后分别取2mL注入具塞磨口比色管(1.2cmx5.0cm),每个测试浓度设置 三个平行对照组和一•个空白对照组；取2mL已经培养好的菌液置于盛有适量 3%NaCl溶液的三角瓶中，用磁力搅拌器强力搅拌30min,吸取0.5mL菌种稀释 液注入各比色管，加塞，上下强力振荡10次，去塞，用DXY-2型生物毒性测试 仪测定15min时的发光菌发光强度［⑵。
7、注意事项：(1) 、菌种需定期转接，斜面、菌液等避光保存；(2) 、发光菌法光不太稳定，因时间、温度、菌量等的变化而改变，需在稳定 环境下操作；(3) 、最好用对数生长期的菌种；(4) 、苯酚属易挥发有机物，使用时需格外注意。