微生物实验室培养的基本操作微生物实验室培养的基本操作1. 1. 器具的灭菌器具的灭菌2. 2. 培养基的配制培养基的配制3. 3. 培养基的灭菌培养基的灭菌4. 4. 倒平板倒平板5. 5. 微生物接种微生物接种6. 6. 恒温箱中培养恒温箱中培养7. 7. 菌种的保存菌种的保存2021/8/251 培养基配制原理• 微生物的生长繁殖时需要各种营养物质，一般包括水、无机盐、碳源和氮源，有的还需要少量特殊营养物质（生长因子）根据微生物的种类和实验目的不同，选择不同的原料配制不同培养基本课题使用牛肉膏蛋白胨培养基，它是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基，也称普通培养基它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl，其中牛肉膏为细菌提供碳源和能源，磷酸盐；蛋白胨主要提供氮源；而NaCl提供无机盐在配制固体培养基时还要加入琼脂作凝固剂在培养细菌时要用稀酸或稀碱将pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖2021/8/252 四、实验操作四、实验操作(一一)制备牛肉膏蛋白胨培养基制备牛肉膏蛋白胨培养基(用于培养细菌用于培养细菌)2021/8/253 1．计算、称量．计算、称量2．溶化．溶化3．调．调pH： ： pH7．．6 4．过滤：这一步可以省去。
．过滤：这一步可以省去5．分装：分装过程中注意不要使培．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染分装三角烧瓶的量以塞而引起污染分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜不超过三角烧瓶容积的一半为宜6．加塞．加塞7．包扎．包扎操作步骤操作步骤2021/8/254 8．灭菌．灭菌: 将将50ml培养基用玻棒转移至三角培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为、温度为121℃，灭菌，灭菌15～～30min将培养皿用旧报纸包裹，放将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在入干热灭菌箱内，在160～～170 ℃下灭下灭菌菌2h2021/8/255 倒平板技术倒平板技术1.将灭过菌的将灭过菌的培养皿放在火培养皿放在火焰旁的桌面上，焰旁的桌面上，右手拿装有培右手拿装有培养基的锥形瓶，养基的锥形瓶，左手拨出棉塞左手拨出棉塞12342021/8/256 倒平板技术倒平板技术2.右手拿锥形右手拿锥形瓶，使瓶口迅瓶，使瓶口迅速通过火焰。
速通过火焰12342021/8/257 倒平板技术倒平板技术12343.用左手的拇指用左手的拇指和食指将培养皿和食指将培养皿打开一条稍大于打开一条稍大于瓶口的缝隙，右瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的手将锥形瓶中的培养基培养基(约约10~20mL)倒入培养倒入培养皿，左手立即盖皿，左手立即盖上培养皿的皿盖上培养皿的皿盖2021/8/258 倒平板技术倒平板技术12344.等待平板冷等待平板冷却凝固，大约却凝固，大约需需5~10min然后，将平板然后，将平板倒过来放置，倒过来放置，使皿盖在下，使皿盖在下，皿底在上皿底在上2021/8/259 9．倒平板．倒平板: 待培养基冷却到待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒左右时，在酒精灯附近倒平板倒平板操作见课本）精灯附近倒平板倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接后观察平板，无杂菌污染才可用来接种种. 10．无菌检查：．无菌检查： 将灭菌的培养基放入将灭菌的培养基放入37℃的温室中培的温室中培养养24—48小时，以检查灭菌是否彻底小时，以检查灭菌是否彻底2021/8/2510 平板划线的操作方法平板划线的操作方法2021/8/2511 2021/8/2512 2021/8/2513 2021/8/2514 2021/8/2515 2021/8/2516 2021/8/2517 2021/8/2518 2021/8/2519 2021/8/2520 2021/8/2521 一旦划破，会造成划线不均匀，一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；难以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
处生长，会形成一个条状的菌落2021/8/2522 一旦划破，会造成划线不均匀，一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；难以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落处生长，会形成一个条状的菌落2021/8/2523 2021/8/2524 2021/8/2525 注意：注意： 1、、 移液管需要经过灭菌操作移液管需要经过灭菌操作时，试管口和移液管离火焰时，试管口和移液管离火焰1~2cm处处.2021/8/2526 微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养2021/8/2527 微生物的恒温培养微生物的恒温培养2021/8/2528 斜面制备培养基配制分装灭菌摆放斜面2021/8/2529 接种的注意点：（1）用接种环取菌种之前、每次划线之前和划线结束都要进行灼烧灭菌，灼烧后要在酒精灯附近冷却后再操作；（2）划线时不要划破培养基，如果采用分段划线法操作从第二次操作应总在上一次划线末端开始，首尾区不能相连；（3）操作必须始终在酒精灯火焰旁进行。
2021/8/2530 菌种的保存菌种的保存1.临时保藏临时保藏：： 接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后置养基，菌落长成后置于于4℃冰箱保存冰箱保存2.长期保存长期保存：： 甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法2021/8/2531 （一）培养基的制作是否合格（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中如果未接种的培养基在恒温箱中保温保温1～～2 d后无菌落生长，说明培养后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新基的制备是成功的，否则需要重新制备2021/8/2532 （二）接种操作是否符合无菌要求（二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习求，需要分析原因，再次练习2021/8/2533 。